陶 鵬 趙彥婷 岳智臣 雷娟利 李必元

(浙江省農業(yè)科學院蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

植物MADS-box 蛋白家族由一類包含MADS-box結構域的轉錄調控因子組成[1－2]，在植物花器官分化、開花時間調控以及果實成熟中扮演著重要的角色[3－4]。SVP 蛋白包含典型的MICK 結構域，屬于MADS-box 蛋白家族中StMADS11 亞家族的一員。此外，SVP 是植物開花負調控因子[5－6]。SVP 可與FLC(FLOWERING LOCUS C)形成復合體抑制開花啟動基因的表達，從而實現(xiàn)開花推遲[7]。研究顯示SVP 蛋白也可以通過直接結合pri-miR172a 啟動子，以抑制miR172 的轉錄，通過調控miR172 及其靶基因的表達推遲開花[8]。SVP 蛋白還可以通過結合到FT與SOC1 基因的啟動子CArG 盒上以抑制FT、TSF和SOC1 的轉錄表達，從而推遲開花[9－10]。

在模式植物擬南芥中，AGL24 是SVP的旁系同源基因，兩者基因序列相似，但生物學功能相反[11]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，AtAGL24 是一種劑量依賴型的開花促進基因，在頂端分生組織中調控開花[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，菜心(Brassica campestrisL. ssp.chinensisvar.utilisTsen et lee)BrAGL24 的mRNA 可在甘藍/菜心異源嫁接體中進行長距離運輸[13]。在擬南芥和青花菜中也發(fā)現(xiàn)AGL24 的mRNA 可長距離移動并促進接穗提前開花[14]。而序列相似的SVP基因是否也具有mRNA 長距離運輸?shù)奶匦陨胁磺宄Ｄ壳俺２捎脴嫿ó愒醇藿芋w并結合轉錄組測序來批量研究穗砧之間的mRNA 運輸。在葡萄嫁接體中，通過轉錄組測序檢測到3 333 個基因的mRNA 可在穗砧之間運輸[15]。在煙草/擬南芥異源嫁接體中檢測到擬南芥中有138 個基因的mRNA 運輸?shù)綗煵葜衃16]。在煙草/番茄異源嫁接中鑒定到1 096 個基因的mRNA 穿過嫁接連接處進行垂直方向的運輸[17]。本研究構建了甘藍/菜心異源嫁接體，并對砧木菜心花序軸進行轉錄組測序，利用種間差異序列在菜心轉錄組測序文庫中篩選到來自甘藍(Brassica oleraceavar L.capitataL.)的BoSVPmRNA read，比較砧木菜心中外源BoSVP和內源BrSVP之間的read 數(shù)量差異，分析嫁接體的砧木菜心花序軸和菜心實生苗花序軸中SVP的轉錄表達情況，以期為深入解析甘藍/菜心嫁接誘導接穗提早開花的分子機制提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

甘藍G27 和49 菜心種子來自浙江省農業(yè)科學院蔬菜所。將甘藍G27 種子播于穴盤中，49 菜心種子晚一周播種。待甘藍G27 生長至45 d，將其莖尖嫁接到49菜心的花序軸上，構建甘藍/菜心嫁接體，留6 株49 菜心實生苗繼續(xù)生長作為對照組。嫁接后30 d，對甘藍/菜心嫁接體的嫁接處下方1 cm 的菜心花序軸進行取樣(標記為T1、T2 和T3)，對菜心實生苗相對應部位的花序軸進行取樣作為對照組(標記為T4、T5、T6)。RNA提取、轉錄組測序工作均由北京百邁客公司完成。

1.2 甘藍BoSVP 和菜心BrSVP 的mRNA 全長序列的獲得

參考甘藍SVP基因(Bo4g149800)序列，從甘藍實生苗的轉錄組測序文庫中篩選甘藍SVP基因的read，并拼接獲得甘藍SVP基因的mRNA 全長序列，命名BoSVP。參考白菜Brassica rapassp.pekinensis SVP基因(Bra030228)的序列，從菜心實生苗的花序軸的轉錄組測序文庫中篩選菜心SVP的read，拼接并獲得菜心SVP基因(命名為BrSVP)的mRNA 全長序列。

1.3 甘藍BoSVP 和菜心BrSVP 的雜合SNP 分析和種間差異序列的選擇

基于甘藍轉錄組測序各樣品的read，使用TopHat2[18]與甘藍參考基因組序列進行比對，使用GATK The Genome Analysis Toolkit[19]軟件識別測序樣品與參考基因組間的單堿基錯配，識別潛在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點，并標注BoSVP中雜合的SNP 位點?；诓诵霓D錄組測序各樣品的read，使用TopHat2 與白菜參考基因組序列進行比對，使用GATK 識別測序樣品與參考基因組中的單堿基錯配，使用簡并堿基標注菜心BrSVP的雜合SNP 位點。GATK 識別標準如下:(1)35 bp 范圍內連續(xù)出現(xiàn)的單堿基錯配不超過3 個；(2)經過序列深度標準化的SNP 質量值大于2.0。使用Clustal Omega 將BoSVP和BrSVP進行序列比對，在5′UTR、編碼區(qū)以及3′UTR 中均勻標注種間差異序列并進行編號，以備后期篩選read。

1.4 種間差異序列的比較評估

為評估種間差異序列的準確性，以每一個種間差異序列及其反向互補序列作為檢索序列，使用UltraEdit 軟件在砧木菜心T1、T2 和T3 文庫中篩選菜心BrSVP的read，并統(tǒng)計數(shù)量。由于每個文庫中的read 總數(shù)不一致，需要對種間差異序列檢索到read 數(shù)量進行標準化。本研究采用RPKM reads per kilobase per million mapped reads 的計算方法對所獲得read 數(shù)量進行標準化，使用Excel 表格制圖。計算相鄰兩組read 數(shù)量的標準偏差，評估種間差異序列的準確性。

1.5 BoSVP mRNA 運輸分析

分別以種間差異序列G7 和G8 及其對應的反向互補序列作為檢索序列，使用UltraEdit 軟件在甘藍/菜心嫁接的砧木菜心花序軸轉錄組測序文庫(T1～T3)和對照組菜心實生苗的花序軸轉錄組測序文庫(T4～T6)中篩選來自甘藍的BoSVP的mRNA 運輸?shù)膔ead，并以R 開頭分別命名為R1、R2、……。為進一步驗證從甘藍中篩選出來的read 來自于甘藍的BoSVP序列，將篩選出的reads 與BrSVP和BoSVP序列進行比對。如果read 的序列與BoSVP序列一致，說明甘藍BoSVP的mRNA 長距離運輸?shù)搅苏枘静诵闹小?/p>

1.6 SVP 基因表達分析

采用RPKM 作為衡量轉錄表達水平的指標，計算甘藍/菜心嫁接體的砧木菜心花序軸和菜心實生苗的花序軸中SVP的轉錄表達情況。

2 結果與分析

2.1 甘藍和菜心SVP 基因序列的比較及雜合SNP的鑒定

以甘藍全基因組測序數(shù)據為參考，分析甘藍BoSVP基因的SNP 變異情況，結果顯示BoSVP基因在5′UTR、編碼區(qū)和3′UTR 均未發(fā)現(xiàn)SNP 變異位點，無雜合SNP 位點。參考白菜全基因組數(shù)據，基于菜心葉片轉錄組測序數(shù)據，分析49 菜心BrSVP基因的SNP變異情況，結果顯示BrSVP在編碼區(qū)中存在4 個雜合位點(圖1)。

將甘藍BoSVP和菜心BrSVP的mRNA 全長序列進行比對，顯示兩者在序列上相似性極高。當除去菜心的4 個雜合SNP，兩者在編碼區(qū)中只有4 個核苷酸的差異。而在5′UTR 和3′UTR 之間分別存在6 和16個核苷酸的差異。避開雜合SNP 的干擾，在SVP基因全長mRNA 上選擇了9 條種間差異序列，依次命名為C1～C9，分布在5′UTR、編碼區(qū)以及3′UTR 上，每條種間差異序列總長為30 nt，每條種間差異序列在BoSVP和BrSVP之間至少存在1 個nt 的差異(圖1)。

圖1 甘藍BoSVP 和菜心BrSVP 的mRNA 序列比對Fig.1 Sequence alignment of mRNA of BoSVP and BrSVP

2.2 種間差異序列的評估分析

本研究使用菜心的9 條種間差異序列(C1～C9)在菜心轉錄組測序文庫T1～T3 中分析菜心BrSVP基因的轉錄本read 數(shù)量，將其標準化并作圖。結果顯示使用相同種間差異序列在不同文庫中(T1、T2 和T3)檢索到read 數(shù)量重復性較好。而使用不同的種間差異序列(C1～C9)在相同文庫中的檢索所獲得的read數(shù)量之間有較大誤差，其中使用位于5′UTR 的C1 和3′UTR 的C9 在T1/T2/T3 文庫中檢索到的read 數(shù)量均明顯低于C2～C8 檢索所獲得的read 數(shù)量(圖2)。比較相鄰兩個種間差異序列檢索所獲得的read 數(shù)量標準差發(fā)現(xiàn)，使用C7 和C8 進行檢索，兩者read 數(shù)量之間的差異最小。位于3′UTR 的C7 和C8 在BoSVP和BrSVP中分別存在4 個和5 個nt 的差異，序列本身的特異性較高，檢索獲得的read 數(shù)量之間的差異小，重復性最好。

圖2 檢索所獲read 數(shù)量的標準化值Fig.2 The standardized value of the number of the retrieved reads

2.3 甘藍BoSVP 基因mRNA 運輸研究

本研究使用特異性和重復性較好的G7 和G8 序列在砧木菜心的轉錄組測序文庫(T1～T3)和菜心實生苗的轉錄組測序文庫(T4～T6)中篩選來自甘藍的BoSVPmRNA read。在菜心實生苗的花序軸轉錄組測序文庫(對照組)中均未找到甘藍BoSVPread，而在嫁接苗菜心的轉錄組測序文庫中找到了潛在的異源read(表1)。

表1 甘藍BoSVP mRNA 運輸?shù)膔ead 數(shù)量Table 1 The number of transported reads of BoSVP mRNA

為驗證砧木菜心中識別的異源read 是否來自接穗甘藍的BoSVP，從T1～T3 文庫中提取這些異源read序列，實際獲得的異源read 共有11 個，并命名為R1～R11(圖3)。來自T1 文庫中的R3 中同時含有完整的G7 和G8 種間差異序列，使用G7 和G8 均能檢索到，R3 在G7 和G8 中各計入1 次。對上述提取的11 條運輸read 進行序列比對，結果顯示R1～R11 均屬于甘藍的BoSVP基因。R1 3′端有一段34 nt 的序列不屬于BoSVP基因(圖3)，將其分別在甘藍基因組和白菜基因組進行比對，顯示R1 的這段34 nt 的序列仍屬于甘藍基因組。

圖3 砧木菜心中的異源read(R1～R11)與甘藍BoSVP和菜心BrSVP 的序列比對Fig.3 The heterologous reads (R1-R11) from rootstocks of the grafted seedlings were aligned with BoSVP and BrSVP

2.4 甘藍BoSVP 基因mRNA 運輸對砧木菜心中SVP 轉錄表達量的影響

砧木菜心花序軸中SVP基因的轉錄表達包括內源的BrSVPmRNA 和外源的BoSVPmRNA。為比較內源BrSVPmRNA 和外源BoSVPmRNA 之間數(shù)量，本研究使用C7/G7 和C8/G8 兩組種間差異序列在砧木菜心轉錄組測序文庫T1/T2/T3 中進行檢索。結果顯示在T1、T2 和T3 中外源運輸?shù)腂oSVPmRNA read 數(shù)量明顯少于內源表達的BrSVPmRNA read 數(shù)量(圖4)。對菜心實生苗的花序軸和甘藍/菜心嫁接體的菜心花序軸中的SVP基因的轉錄表達情況進行分析，結果顯示SVP基因在菜心實生苗花序軸(對照組)和嫁接苗的菜心花序軸中的轉錄表達量差異小于2 倍，P值等于0.81，兩組數(shù)據差異不顯著(圖5)。

圖4 不同文庫中內源BrSVP 和外源BoSVP read 數(shù)量Fig.4 The number of endogenous BrSVP reads and exogenous BoSVP reads in different library

圖5 SVP 基因在菜心花序軸中的轉錄表達量(P 值＝0.81)Fig.5 The transcriptional expression of SVP gene in inflorescence stems of Caixin (P value＝0.81)

3 討論

利用甘藍和菜心SVP基因之間的種間差異序列，在甘藍/菜心異源嫁接體的砧木菜心花序軸的轉錄組測序文庫中可以準確篩選到甘藍BoSVPmRNA 長距離運輸?shù)膔ead。選擇的種間差異序列中不能出現(xiàn)雜合的SNP。由于自身的雜合SNP 可能會導致異源BoSVP的錯誤識別。所以選擇種間差異序列進行菜心BrSVP內源表達評估時候，應盡量避免使用位于mRNA 兩端的種間差異序列。在分析菜心砧木轉錄組測序文庫中鑒定異源甘藍的BoSVPmRNA 的reads時，種間差異序列中的差異核苷酸越多，其特異性越高，所獲得的異源甘藍BoSVPmRNA 可信度越高。使用不同位置的種間差異序列評估菜心內源BrSVPread值時，顯示位于BrSVP5′UTR 和3′UTR 兩端的種間差異序列獲得菜心內源BrSVPread 值與其他差異序列所獲得值的偏差較大，可能與mRNA 兩端所獲得測序機會較少有關。

本研究利用G7 和G8 在砧木菜心的轉錄組測序文庫中鑒定到來自甘藍BoSVP的11 條mRNA read，在每個嫁接體的砧木菜心的轉錄組測序文庫中均找到了1～3 個甘藍BoSVPread。mRNA 的長距離運輸是一個極其復雜的過程，當前尚未形成統(tǒng)一的觀點[20－21]。前期研究認為mRNA 運輸可能與mRNA 的序列和基序有關[22]。SVP與AGL24 在序列上具有相似性，同時兩者均具有mRNA 運輸?shù)奶匦訹13]，暗示某些保守的序列決定了SVP基因的mRNA 的運輸。比如，擬南芥GAI基因mRNA 在3′UTR 區(qū)和編碼區(qū)的特定基序和序列介導了其mRNA 在嫁接體中的運輸[23]，馬鈴薯(Solanum tuberosum)StBEL5 基因的mRNA 可在韌皮部移動，其3′UTR 決定了mRNA 的穩(wěn)定性及其運輸?shù)礁康哪芰24－25]。但一些研究推測伴胞中mRNA 的豐度是mRNA 長距離運輸?shù)年P鍵因素[26－27]。后期研究需要明確BoSVPmRNA 運輸?shù)姆肿訖C制。BoSVP的mRNA 從接穗甘藍運輸?shù)秸枘静诵闹?，通過比較砧木菜心中異源BoSVPmRNA 的reads 和內源BrSVPmRNA 的read 數(shù)量，顯示運輸?shù)秸枘静诵闹械腂oSVPmRNA 的read 占內源BrSVPread 的不足1%(圖4)。BoSVP的mRNA 運輸并不能明顯改變砧木菜心中SVP的表達量。SVP基因在甘藍/菜心嫁接體的菜心花序軸和菜心實生苗花序軸中的轉錄表達量沒有差異，說明BoSVPmRNA 的運輸幾乎不影響砧木菜心中SVP的表達水平，推測BoSVPmRNA 的運輸不會影響菜心中SVP在花序軸中的功能。砧木菜心中異源BoSVPmRNA read 全部來自于接穗甘藍，理論上將會導致莖尖中甘藍BoSVP的mRNA 含量減少。甘藍BoSVP是抑制開花基因，接穗甘藍中SVPmRNA 的持續(xù)減少，可能促進甘藍提早開花。前期利用甘藍/菜心的異源嫁接促進了接穗甘藍的提前開花[28－29]。在甘藍/菜心嫁接體中，發(fā)現(xiàn)砧木菜心的開花促進基因AGL24 的mRNA 從砧木運輸?shù)浇铀敫仕{中[13]。甘藍/菜心嫁接促進接穗甘藍提早開花可能是大量開花促進基因mRNA 向上運輸和開花抑制基因mRNA 向下運輸綜合導致的結果。一些研究認為植物中一些基因的mRNA 可作為信號在穗砧中進行長距離運輸并參與生長發(fā)育調控[30－31]，SVP和AGL24 均為開花調控轉錄因子基因，SVP和AGL24 運輸?shù)膍RNA 有可能在甘藍/菜心嫁接體中發(fā)揮調控開花的作用。

4 結論

本研究結果表明，甘藍BoSVPmRNA 可從接穗甘藍運輸?shù)秸枘静诵闹校挥绊懻枘静诵闹蠸VP基因的轉錄表達量，同時證明其旁系同源基因SVPmRNA也可長距離運輸。由于未提出與BoSVPmRNA 運輸直接相關的序列和結構，后期應將mRNA 運輸屬性與基因序列和結構進行關聯(lián)分析。本研究為植物基因mRNA 運輸機制研究提供了基礎數(shù)據。