武衛(wèi)紅，李瓊潔，徐 晶，史夢(mèng)圓

(1.平頂山市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，平頂山 467000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450000)

肺癌已成為全球發(fā)病率和致死率最高的腫瘤疾病，占所有腫瘤疾病的12.4%，其中85% 屬于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。靶向治療能提高NSCLC患者的生存率，已成為主要治療手段[2-3]。NSCLC患者中有50%～80% 表皮生長因子受體(EGFR)表達(dá)陽性[4]。EGFR活化后與其配體(表皮生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子α等)結(jié)合激活酪氨酸激酶區(qū)域，從而導(dǎo)致多條信號(hào)通路開啟[5]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移及死亡。吉非替尼(易瑞沙)是由阿斯利康首先研發(fā)而成的EGFR分子靶向藥物，于2003年批準(zhǔn)用于治療NSCLC。Ki-67屬于細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，在靜息細(xì)胞中不表達(dá)，僅在增殖細(xì)胞中高度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與多種腫瘤有關(guān)，可用于腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測[6-7]。本研究通過吉非替尼治療NSCLC患者EGFR突變的療效及其與Ki-67表達(dá)的關(guān)系研究，探究Ki-67的表達(dá)是否與吉非替尼療效存在相關(guān)性，旨在為NSCLC臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取經(jīng)病理診斷為NSCLC并進(jìn)行EGFR突變檢測的94例患者，其中男性58例，女性 36例，年齡為45～78歲，平均(53.47±5.69) 歲。通過胸水、痰液、支氣管鏡、穿刺活檢等獲取標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，根據(jù)病理類型進(jìn)行分組：其中腺癌61例，鱗癌33例；有吸煙史69例，無吸煙史25例；年齡<60歲36例，≥60歲58例；腫瘤位置分類：周圍型44例，中央型50例；按腫瘤分化程度分類：中高分化56例，低分化38例；腫瘤直徑≥3 cm 39例，直徑<3 cm 55例，73例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，21例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。根據(jù)國際通用腫瘤(TNM)分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，Ⅲ期57例，Ⅳ期37例。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且所有患者簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為NSCLC者；②抗腫瘤治療前進(jìn)行腦CT或MR、胸部CT掃描、腹部CT或B超,全身ECT骨掃描檢查或PET-CT進(jìn)行腫瘤基線評(píng)估者；③研究前未接受任何化療或放療等手段進(jìn)行抗癌治療者；④有可測量的局部病灶或轉(zhuǎn)移病灶者；可以得到能夠進(jìn)行基因分析的腫瘤組織者；⑤年齡>18歲者；體力狀況(ECOG)評(píng)分為0～3分者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷組織學(xué)分類不清者：②伴有其他腫瘤者；③病理診斷為小細(xì)胞肺癌者；④精神障礙患者；⑤研究過程中病歷資料缺失或中途退出研究者。

1.2治療方法

1.2.1EGFR突變檢測方法 所有試驗(yàn)檢測均在河南省腫瘤醫(yī)院血液腫瘤病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。對(duì)標(biāo)本采集和評(píng)估后，進(jìn)行DNA抽提和質(zhì)控，采用測序法進(jìn)行檢測：引物自行設(shè)計(jì)，經(jīng)上海生物公司合成，通過巢式PCR擴(kuò)增EGFR基因的18～21外顯子，進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序和基因突變分析，各蛋白引物見表1。DNA提取、PCR和序列分析具體操作：通過活檢或者灌洗液獲得治療前的腫瘤組織標(biāo)本，通過固定、脫水、石蠟包埋后切片，制成5 μm的樣本。另取新鮮組織50 mg，根據(jù)Trizol提取試劑盒，提取組織DNA，通過巢式PCR法擴(kuò)增EGFR的18～21外顯子片段。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，2 min 30 s；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；68 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)。

表1 18～21外顯子引物設(shè)計(jì)

1.2.2Ki-67含量表達(dá)檢測 取腫瘤標(biāo)本后用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片4 μm樣本，HE染色和DAB染色，用雙蒸水洗滌。用中性樹膠封片。由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師隨機(jī)抽取薄片，在每張切片中選5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，Ki-67表達(dá)陽性為細(xì)胞核為棕色顆粒。Ki-67 陽性表達(dá)強(qiáng)度表示如下：(1)-：陽性細(xì)胞數(shù)占總數(shù)小于5%；(2)+：陽性細(xì)胞數(shù)占總數(shù)5%～25%；(3)+ +：陽性細(xì)胞數(shù)占總數(shù)26%～50%；(4)+++：陽性細(xì)胞數(shù)占總數(shù)>50%。陽性率=(+～+++細(xì)胞數(shù))÷總數(shù)×100%。免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2.3吉非替尼靶向治療 入選患者均采用靶向藥物吉非替尼(易瑞沙，規(guī)格：0.25 g，阿斯利康有限公司)治療。給藥劑量為每次250 mg，每日1次，直至患者不耐受或腫瘤進(jìn)展而終止治療。用藥時(shí)間最短為3個(gè)月，最長達(dá)10個(gè)月。納入研究的患者在治療期間均不采用其他抗腫瘤藥物或其他手段治療，治療期間記錄詳細(xì)病程。

1.3觀察指標(biāo) 依據(jù)實(shí)體瘤治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)-RECIST[9]進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，所有腫瘤檢測、腫瘤病灶大小基線資料在治療前5 d完成。臨床療效評(píng)價(jià)如下：①完全緩解(CR)：所有病灶消失；②部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小至少30%；③疾病進(jìn)展(PD)：基線病灶長徑總和增加至少20%；④疾病穩(wěn)定(SD)：病灶減小程度未達(dá)到PR，增加程度也未達(dá)到PD?？陀^緩解率(ORR)=(CR+PR)÷總例數(shù)×100%，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)÷總例數(shù)×100%。

記錄所有患者無疾病進(jìn)展時(shí)間(PFS)，即腫瘤患者從第1次接受藥物治療至出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間。記錄所有患者總生存期(OS)，即第1次接受藥物治療至患者死亡或末次隨訪時(shí)間。數(shù)據(jù)截止日尚生存的患者或在研究中失訪的患者，將以最后1次隨訪日期結(jié)尾數(shù)值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1基因突變情況 納入研究的所有患者無病例脫落和隨訪丟失情況，共94例患者進(jìn)行EGFR檢測，突變58例(58/94,61.70%)。19號(hào)外顯子突變24例(24/94,25.53%)，21號(hào)外顯子突變20例(20/94,21.28%)，20號(hào)外顯子突變11例(11/94,11.70%)，18號(hào)外顯子突變3例(3/94,3.19%)；33例為單點(diǎn)突變，25例為缺失突變。具體情況如下：19號(hào)外顯子中17例發(fā)生單點(diǎn)突變，7例發(fā)生缺失突變，3例突變位點(diǎn)在del2236-2250，4例突變位點(diǎn)在del2235-2249；21號(hào)外顯子中15例為單點(diǎn)突變，5例為缺失突變，突變位點(diǎn)為 L858R 12例，突變位點(diǎn)2573T>G 8例；20號(hào)外顯子突變中8例為單點(diǎn)突變，T790 M突變3例，2350T>C 5例，缺失突變3例，突變位點(diǎn)為del2235-2249；18號(hào)外顯子2例為單點(diǎn)突變，2162G>C 2例，缺失突變1例，位點(diǎn)為del2236-2250。

2.2吉非替尼療效 (1)突變組PFS為6～21.5個(gè)月，中位PFS為15個(gè)月，OS為9～31.7個(gè)月，中位OS為18個(gè)月；野生組PFS為3.4～5.6個(gè)月，中位PFS為4.0個(gè)月，OS為5.2～6.8個(gè)月，中位OS為5.7個(gè)月，見圖1和圖2。突變組的PFS和OS明顯高于野生組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。

圖1 突變組和野生組的PFS比較

圖2 突變組和野生組的OS比較

(2)突變組的臨床療效明顯優(yōu)于野生組(u=2.94，P=0.003)，突變組的ORR明顯高于野生組(χ2=7.35，P=0.007)；突變組的DCR明顯高于野生組(χ2=4.68，P=0.030)，見表2。

表2 突變組與野生組的臨床療效比較

2.3Ki-67在NSCLC患者中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

2.3.1Ki-67在NSCLC患者中的表達(dá) 陽性率免疫組化染色后細(xì)胞核呈棕色顆粒表示Ki-67陽性。94例NSCLC患者中，Ki-67陽性76例(80.85%)，其中+38例，++21例，+++17例。Ki-67 的免疫組化染色圖見圖3。

圖3 Ki-67在NSCLC患者癌組織中的表達(dá)

2.3.2Ki-67表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Ki-67表達(dá)在性別、年齡、是否吸煙、組織學(xué)類型、腫瘤位置和腫瘤直徑方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中高分化患者的Ki-67表達(dá)陽性率明顯高于低分化患者；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Ki-67表達(dá)陽性率明顯高于未轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 Ki-67表達(dá)與臨床病理特征

2.4吉非替尼療效與Ki-67表達(dá)的關(guān)系

2.4.1EGFR突變與Ki-67表達(dá)的關(guān)系 突變組58例患者中，Ki-67表達(dá)陽性56例，陰性2例；野生組36例患者中，Ki-67表達(dá)陽性20例，陰性16例。采用Spearman相關(guān)性分析，Ki-67表達(dá)與EGFR突變呈正相關(guān)(P<0.05)，說明Ki-67表達(dá)陽性則EGFR突變概率越高。見表4。

表4 EGFR突變與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4.2Ki-67表達(dá)與吉非替尼療效的關(guān)系 Ki-67表達(dá)陽性組的臨床療效明顯優(yōu)于陰性組(u=2.958，P=0.003)，陽性組ORR明顯高于陰性組(χ2=7.582，P=0.006)；陽性組的DCR明顯高于陰性組(χ2=4.505，P=0.034)，見表5。此外，Ki-67表達(dá)陽性患者使用吉非替尼治療效果更好，PFS和OS明顯高于Ki-67表達(dá)陰性患者(P<0.000 1)，見圖4和圖5。

表5 Ki-67表達(dá)與吉非替尼療效的關(guān)系

圖4 Ki-67表達(dá)陽性和Ki-67表達(dá)陰性的NSCLC患者PFS比較

圖5 Ki-67表達(dá)陽性和Ki-67表達(dá)陰性的NSCLC患者OS生存比較

3 討論

近年來肺癌的發(fā)病率和致死率均呈上升趨勢(shì)，已位居癌癥首位，特別是發(fā)展中國家。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2025年，我國每年將增加100萬肺癌患者[10]。肺癌早期無明顯癥狀，患者往往不去就診治療，尤其在農(nóng)村，因此，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)肺癌時(shí)已為晚期，顯著降低了患者的生存率。根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和NSCLC，NSCLC包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，臨床多以NSCLC常見，但NSCLC癥狀存在不明顯、易轉(zhuǎn)移、難治療等問題，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存時(shí)間。早期肺癌可接受手術(shù)治療[11]，晚期肺癌多采用化療保守治療，但出現(xiàn)耐藥、治療效果不佳等問題，影響患者的生活質(zhì)量和疾病進(jìn)展時(shí)間，因此，預(yù)測疾病發(fā)展和藥物治療效果成為NSCLC治療的關(guān)鍵問題。根據(jù)《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診斷指南(2018年版)》[12]中的治療方式，對(duì)于肺癌晚期、放化療治療無效的患者首選EGFR抑制劑治療，即抑制EGFR活性，EGFR在NSCLC中高度表達(dá)并激活至磷酸化狀態(tài)，導(dǎo)致下游蛋白磷酸化，從而刺激細(xì)胞增殖、侵襲和抑制凋亡。吉非替尼為EGFR抑制劑，通過抑制EGFR活性，從而減慢腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移[13-14]。2003年剛上市時(shí)，吉非替尼效果不佳，隨后有研究發(fā)現(xiàn)主要是由于吉非替尼的治療效果與EGFR基因突變密切相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)突變主要發(fā)生于女性、無吸煙史和我國東部地區(qū)患者[15-16]。因此，檢測EGFR基因突變是NSCLC患者能否從EGFR抑制劑治療中獲益的重要因素。

研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 突變型 NSCLC 對(duì) EGFR 靶向藥物異常敏感，尤其是外顯子19和外顯子21，在亞洲人群中突變率高達(dá)30%～40%[17]。隨著吉非替尼臨床使用越來越成熟，多項(xiàng)大型研究證實(shí)靶向藥物治療可明顯改善NSCLC患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。本研究在研究前對(duì)所有患者進(jìn)行基因檢測，發(fā)現(xiàn)有58例患者發(fā)生EGFR基因突變，其中主要發(fā)生在外顯子21和19，與此前研究一致。外顯子 19 的LREA基因缺失為主要突變位置，是EGFR抑制劑的作用位點(diǎn)。外顯子21的主要突變位點(diǎn)在L858R，該突變提高了A區(qū)域(A-Loop)穩(wěn)定性和藥物治療效果[18]。吉非替尼作為EGFR抑制劑藥物，可作用于突變靶點(diǎn)，抑制腫瘤生長，增加腫瘤細(xì)胞凋亡。早前細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，L858R突變細(xì)胞株只需0.1 μmol·L-1的吉非替尼就可以抑制細(xì)胞生長，而野生型細(xì)胞株需要10 μmol·L-1，說明吉非替尼對(duì)突變性細(xì)胞株敏感度顯著增加，且突變位點(diǎn)在L858R，臨床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，吉非替尼在普通人群中的治療有效率僅為10%～30%，但在EGFR突變患者中的有效率明顯升高至75%～95%[19]。因此，通過基因篩選可有效提高患者的治療效果，本研究突變組的ORR(72.41%)和DCR(93.19%)均明顯高于野生組(ORR=44.44%，DCR=77.78%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，此外，突變組的PFS和OS也明顯高于野生組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究顯示，吉非替尼治療較化療毒性和不良反應(yīng)更小，療效更佳[20]。一項(xiàng)吉非替尼Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吉非替尼的PFS明顯優(yōu)于鉑類藥物，吉非替尼的OS優(yōu)于鉑類化療2倍[21-22]。本研究證實(shí)了吉非替尼對(duì)于NSCLC的治療效果，但近年來有研究報(bào)道表示，EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥性，患者預(yù)后較之前差[23-24]。目前，臨床上對(duì)于NSCLC患者耐藥性及預(yù)后的預(yù)測尚未找到合適的標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67在其他腫瘤中高度表達(dá)，可作為腫瘤相關(guān)性標(biāo)志物[25-26]，在NSCLC中也有研究顯示，Ki-67表達(dá)與腫瘤細(xì)胞活躍呈正相關(guān)[27]。在G1期Ki-67開始少量表達(dá)，在S期和G2期表達(dá)量明顯增高，至M期表達(dá)量達(dá)最大量。因此，Ki-67表達(dá)水平與EGFR基因突變呈正相關(guān)，可成為EGFR抑制劑治療NSCLC療效的有效預(yù)測指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，Ki-67表達(dá)與EGFR突變呈正相關(guān)(P<0.05)，說明Ki-67表達(dá)陽性則EGFR突變概率越高?？捎肒i-67預(yù)測吉非替尼的治療效果。

綜上所述，本研究明確了吉非替尼對(duì)于基因突變敏感度高的NSCLC的治療效果，并初步證實(shí)了Ki-67表達(dá)水平與EGFR突變的關(guān)系，Ki-67可作為吉非替尼治療NSCLC療效的預(yù)測指標(biāo)之一，對(duì)于EGFR突變敏感性尚不確定的患者，通過檢測Ki-67可以為臨床醫(yī)生選擇EGFR突變檢測提供一定的參考，從而使患者更好地從EGFR抑制劑治療中獲益。但Ki-67對(duì)吉非替尼治療NSCLC療效的具體預(yù)測價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。