段成剛,張 偉,王建綱

[太原鋼鐵(集團)有限公司總醫(yī)院/山西醫(yī)科大學第六醫(yī)院,山西 太原030001]

隨著經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高,目前我國動脈粥樣硬化(ASO)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。ASO主要發(fā)生在大中動脈的血管內皮細胞中,內皮細胞損傷是發(fā)生ASO的基本病理條件。內皮細胞是附著于血管壁表面的一層單核細胞,可分隔血液和血管壁,防止內皮下膠原暴露,具有分泌多種血管活性物質、調節(jié)血管緊張性、抑制血管平滑肌細胞增殖和血管壁炎性反應的作用,還能有效抑制血栓形成,保護血管壁,一旦血管內皮細胞損傷,內皮下膠原暴露,血管壁舒縮能力下降,就會導致患者發(fā)生高血壓病、ASO等疾病[2]。人體內有多種物質可引起血管內皮細胞損傷,如氧化應激反應產生過多的氧自由基,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)產生的血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、低密度脂蛋白(LDL)及內皮細胞受刺激時釋放的內皮微顆粒等[3]。在病變早期,血管內皮細胞表面會出現大量的血管細胞黏附分子-1(VCAM-1),VCAM-1具有介導單核細胞與血管內皮黏附的作用,隨后陸續(xù)出現其他血管黏附分子,共同介導細胞與血管內皮的黏附,使得黏附效率顯著升高,并吸引血液循環(huán)中單核細胞、中性粒細胞等炎癥細胞黏附于受損的血管內皮表面,單核細胞激活后,可進入血管內皮下,并吞噬脂質形成大量泡沫細胞,大量泡沫細胞存在于血管內皮細胞下會不斷抬高血管內皮細胞,使血流受阻,介導ASO發(fā)生[4]。紅花具有活血通絡、化瘀止痛功效。藥理研究表明,羥基紅花黃色素是紅花的主要活性成分,是一種查爾酮葡萄糖苷[5],廣泛用于血液循環(huán)障礙性疾病,如冠心病、腦血管疾病,效果良好。本研究分析羥基紅花黃色素A(HSYA)對血管內皮細胞黏附功能的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 4周齡大小的清潔級雄性SD大鼠20只,動物許可證號：SCXK(晉)2019-11,體質量120～150 g,予清潔級喂養(yǎng),室溫維持在23℃。

1.2 藥物及試劑 羥基紅花黃色素A(太原華衛(wèi)藥業(yè)有限公司)。酶聯免疫吸附試驗試劑盒：大鼠可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1,浙江聯科生物科技有限公司)、大鼠可溶性血管間黏附因子-1(s VCAM-1,博士德生物)、大鼠內皮素-1(ET-1,博士德生物)、兔抗人細胞間黏附分子-1(ICAM-1,美國Proteintech公司)、鼠抗人β-actin抗體(美國Abgent公司)、兔抗鼠ICAM-1、VCAM-1抗體(美國Proteintech公司)、二抗(美國Sigma公司)。DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器 光學顯微鏡尼康E800(日本)；5471R離心機(德國Eppendorf公司)；超凈工作臺(中國超凈工作臺制造商)。

2 實驗方法

2.1 分組 將20只4周齡大小的清潔級SD大鼠隨機分為對照組和HSYA組,每組10只。HSYA組給予靜脈滴注羥基紅花黃色素A 100 mg＋0.9%氯化鈉注射液250 m L,每日1次,14 d為1個療程。對照組大鼠靜脈滴注0.9%氯化鈉注射液250 m L,每日1次。兩組大鼠均給藥2周。

2.2 臟器組織分離 ①材料：苯巴比妥鈉、福爾馬林、0.9%氯化鈉注射液、酒精、三通管、50 m L針筒、1 m L針筒、穿刺針、衛(wèi)生紙、棉簽、解剖板、剪刀、鑷子、止血鉗、分針、組織凍存管、肝素等。②步驟：麻醉前1 d對SD大鼠禁食,次日用2%苯巴比妥鈉進行腹腔注射,用量5～10 m L,注射完畢后將SD大鼠禁食放回籠中,待其失去知覺。將SD大鼠四肢用圖釘固定在解剖板上,進行活體取血,取血后將血液置于肝素沖洗過的管中,室溫放置數小時后以3 500 r/min離心10 min。分離上層血清,分裝后放入超低溫冰箱中保存,用于檢測血清中ICAM-1、VCAM-1、ET-1濃度。隨后解剖大鼠,用鑷子夾起大鼠腹部皮膚,沿腹部中線剪開,再依次剪開皮膚、腹膜,向上達劍突部位,充分暴露整個心臟,用穿刺針平行刺入左心房并保持穩(wěn)定,向心房內注入足量0.9%氯化鈉注射液以轉換全身血液。觀察肝臟膨脹、發(fā)白情況,隨后取下胸主動脈,分離后放入4%多聚甲醛離心管中進行組織固定,剩余動物軀體放入專用冰箱中待專人處理。

2.3 胸主動脈表面ICAM-1、VCAM-1表達測定 ①脫蠟復水：將胸主動脈組織切片,在室溫放置60 min后,浸泡于二甲苯中10 min,之后放入另一個裝有二甲苯的染虹中再放置10 mim,然后將組織切片逐級放入無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各浸泡5 min,最后置于純水中解育5 min,再轉移入磷酸鹽緩沖液(PBS)中解育5min。②抗原修復：首先進行內源性過氧化物酶處理,即滴3%的過氧化氫于切片上解育5 min,然后用PBS浸泡清洗3次,每次5 min,盡可能去除殘留過氧化氫。之后將切片浸入0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液中,置于微波爐中高溫加熱至沸騰并保持8 min,待緩沖液自然降至室溫,用PBS再洗5 min。③免疫反應：用濾紙擦去周圍多余的PBS,并用PBS稀釋的10%正常山羊血清室溫盒封閉0.5 h。第2日,移去一抗,PBS清洗兩遍,每次10 min,滴加二抗工作液,室溫解育0.5 h,移去二抗,PBS清洗兩遍,每次10 min。④化學染色：去除多余PBS,滴加預先配置的二氨基聯苯胺(DAB)染液,濕盒孵育。在顯微鏡下監(jiān)測染色程度,染色結束后,用PBS洗去染液,每次8 min,清洗3次,再用蘇木素復染5 min,復染結束后用水洗去多余染液,以2%鹽酸溶液處理,再次用水清洗。⑤脫水封片：將切片依次浸泡于50%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各5 min,二甲苯透明化處理2次,每次10 min,脫水處理后洗去多余液體,滴1滴中性樹膠,蓋上蓋玻片,除去氣泡。最后用Image pro-plus軟件分析免疫組化結果。

2.4 酶聯免疫吸附試驗及硝酸鹽還原酶反應 取大鼠血清,按照試劑盒說明書要求操作。

3 研究結果

3.1 觀察指標 采用酶聯免疫吸附法測定血清sICAM-1、s VCAM-1、ET-1濃度,運用免疫組化法測定SD大鼠胸主動脈表面ICAM-1、VCAM-1表達。

3.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.3 結果

(1)血清sICAM-1、s VCAM-1及ET-1濃度比較給藥2周后,HSYA組血清sICAM-1、s VCAM-1濃度均低于對照組(P＜0.05)；兩組大鼠血清ET-1濃度比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組SD大鼠可溶性細胞間黏附分子-1、可溶性血管間黏附分子-1、內皮素-1濃度比較(ng/L,±s)

表1 兩組SD大鼠可溶性細胞間黏附分子-1、可溶性血管間黏附分子-1、內皮素-1濃度比較(ng/L,±s)

注：與對照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 可溶性細胞間黏附分子-1可溶性血管間黏附分子-1內皮素-1 HSYA組 10 27.1±2.2▲ 79.5±3.2▲ 301.1±1.5對照組 10 34.3±2.0 103.1±4.2 311.3±4.2

(2)胸主動脈ICAM-1、VCAM-1表達比較 對照組免疫組化結果可見胸主動脈內皮細胞表面存在大量棕黃色顆粒狀陽性染色物質,且部分區(qū)域棕黃色顆粒狀物質融合成片；HSYA組免疫組化結果顯示黃色顆粒狀陽性染色物質明顯少于對照組,見125頁圖1、2。

圖1 對照組免疫組化結果

圖2 HSYA組免疫組化結果

4 討論

紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctoriusL.)的干燥花,味辛,藥性溫和,歸于心、肝經,為血中氣藥,兼具補血與補氣功效。中醫(yī)常用紅花治療女性閉經、痛經、產后惡露不盡及瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌仆損傷、瘡瘍腫痛等血液瘀阻性疾病。小劑量紅花可起到祛瘀生血、益氣養(yǎng)血的功效,大劑量使用則有破血祛瘀的作用。藥理研究表明,紅花含有紅花苷、紅花醍苷、紅花素、二氫黃酮類化合物、多糖類、葡萄糖苷(新紅花苷)、HSYA等[5]。田文靜等[6]研究表明,紅花對心臟具有正性作用,可提高冠狀動脈血容量,臨床以紅花為主治療冠心病,尤其對輕、中度慢性心絞痛患者有顯著療效。紅花還能長時間降低小動物血壓,使狗腎血管強烈收縮,腎血流量減少,并使全血初凝及血液復鈣時間明顯延長[7]。動物實驗研究表明,紅花煎劑可以刺激小鼠、家兔、貓、狗的子宮,使其產生規(guī)律收縮,甚至強烈痙攣[7],因此孕婦不宜使用紅花,對月經過多、有流血趨向的女性患者也不適用或應謹慎使用。

HSYA是一種查爾酮葡萄糖苷,實驗研究表明,其具有激動血管平滑肌β受體、擴張血管、增加冠狀動脈血流量、改善心肌缺血的作用[8]；同時,HSYA能抑制血小板黏附、聚集和釋放,從而抑制血栓形成。內皮細胞損傷被認為是ASO的始動環(huán)節(jié)[9]。人體中存在多種可能造成內皮細胞損傷的物質,其中最主要的是氧化應激過程中產生的過量氧自由基,過量氧自由基儲存在細胞或組織中可引起細胞或組織損傷,尤其是內皮細胞。內皮細胞損傷后,會喪失分隔血液與血管壁的作用,造成內皮下膠原暴露,直接與血液中的各種成分接觸,血液中的血管性血友病因子(vWF)首先與內皮細胞破損處的膠原纖維產生變構效應,介導血小板與膠原纖維結合,同時血小板釋放各種黏附因子,進一步加速血小板與膠原纖維的結合,從而形成聚集效應。

綜上所述,HSYA可明顯降低雄性SD大鼠血清sICAM-1、s VCAM-1水平,抑制其胸主動脈ICAM-1、VCAM-1表達。