欒非時(shí)，閆令文，劉樹森，劉釗，高鵬，宋正峰，朱子成，劉宏宇

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.山東省壽光市三木種苗有限公司，山東壽光 262704；4.濰坊科技學(xué)院農(nóng)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，山東壽光 262799）

西瓜是我國重要水果型蔬菜之一，在園藝作物生產(chǎn)中具有重要地位[1]。西瓜種質(zhì)資源是新品種選育物質(zhì)基礎(chǔ)，西瓜種質(zhì)遺傳背景狹窄一直是限制我國西瓜育種發(fā)展重要因素[2]。傳統(tǒng)育種手段周期長(zhǎng)、見效慢、連鎖累贅難以消除，利用分子標(biāo)記輔助背景選擇，可加快遺傳背景恢復(fù)速度，縮短育種周期[3-4]。在分子水平上研究西瓜種質(zhì)資源親緣關(guān)系，將極大降低遺傳背景相似的組合，提高育種科學(xué)性與可行性，因此篩選一套用于西瓜背景選擇的分子標(biāo)記，研究西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性，將為今后西瓜育種提供理論基礎(chǔ)。

背景選擇對(duì)象范圍廣，幾乎遍布作物基因組。因此在開展背景選擇時(shí)，應(yīng)盡可能選用均勻分布在染色體上的分子標(biāo)記[5]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Sim?ple sequence repeat，SSR）標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、對(duì)DNA質(zhì)量要求低等優(yōu)勢(shì)[6]，廣泛應(yīng)用于園藝作物背景選擇、遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜、品種鑒定等研究[7-8]。王振選用331對(duì)SSR引物對(duì)玉米兩親本開展擴(kuò)增，篩選出多態(tài)性較高的SSR引物60對(duì)作背景選擇，BC2F1群體背景回復(fù)率平均值為87.36%[5]。張兆輝等篩選出21對(duì)SSR引物，擴(kuò)增82份瓠瓜種質(zhì)資源，將其分為三大類群[9]。段紅梅利用198對(duì)SSR引物，篩選出均勻覆蓋在大豆全基因組上的51對(duì)SSR引物研究背景選擇效果，結(jié)果表明20對(duì)引物與51對(duì)引物背景選擇效果相似[10]。劉基生等選用200對(duì)SSR引物，對(duì)101份甘藍(lán)材料作標(biāo)記，篩選得到36對(duì)多態(tài)性較高引物，最終將供試材料分為8個(gè)類群，并選出23份具有代表性自交系材料[11]。董冬利用覆蓋小麥全基因組114對(duì)SSR引物，篩選出多態(tài)性較高SSR引物46對(duì)用于遺傳背景回復(fù)率分析，BC1F2個(gè)體遺傳回復(fù)率平均為76.2%[12]。武向斌在美洲南瓜全基因組上開發(fā)38 104個(gè)SSR標(biāo)記，利用66對(duì)SSR引物，將61份南瓜種質(zhì)材料聚為野生種和栽培種兩大類[13]。張慕月利用23對(duì)SSR引物，分析276份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，將供試材料聚為5個(gè)類群[14]。史建磊等選用37對(duì)SSR引物對(duì)48份黃瓜材料擴(kuò)增，將這些材料聚為4類[15]。

本研究在446對(duì)SSR引物中篩選出在西瓜11條染色體上分布相對(duì)均勻、多態(tài)性較高的110對(duì)SSR引物，建立一套用于西瓜背景選擇的分子標(biāo)記，結(jié)合聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析等方法，研究81份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，為篩選培育西瓜新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)81份西瓜種質(zhì)材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種團(tuán)隊(duì)保存。按照西瓜屬分類方法，將81份西瓜種質(zhì)材料分為5類變種，西瓜種（C.lanatus）69份，毛西瓜變種（C.lanatus var.lanatus）8份，飼用西瓜變種（C.colo?cynthis var.citroides）1份，藥西瓜種（C.colocynthis）2份，熱迷西瓜種（C.rehmii）1份，81份西瓜種質(zhì)材料信息（見表1）。

表1 81份西瓜種質(zhì)資源信息Table 1 Information on 81 watermelon germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 田間試驗(yàn)方法

①植株管理

試驗(yàn)材料于2019年3月下旬種植于黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范基地5號(hào)大棚。采取隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每份材料種植5株，株行距80 cm×50 cm，每個(gè)小區(qū)間種植京穎作為保護(hù)行。取81份西瓜種質(zhì)材料種子，每份10粒，紗布包裹，標(biāo)明材料名稱。溫湯浸種12 h，32℃恒溫箱中催芽，待80%種子露白后，使用營養(yǎng)缽育苗，播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心1號(hào)溫室。5月上旬定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范基地大棚內(nèi)，采用吊蔓栽培，雙蔓整枝，人工授粉，為避免營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，每株僅留1個(gè)瓜，正常田間管理，授粉45 d后收獲西瓜果實(shí)，并測(cè)定性狀指標(biāo)。

②果實(shí)性狀調(diào)查

本研究調(diào)查81份西瓜種質(zhì)材料9種農(nóng)藝性狀，包括果實(shí)重量、果實(shí)長(zhǎng)度、果實(shí)寬度、果皮厚度、中心果肉可溶性固形物含量、果肉可溶性固形物含量、種子長(zhǎng)度、種子寬度、種子厚度。具體方法參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[16]。

1.2.2 分子試驗(yàn)方法

①DNA提取

在幼苗期采集幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取西瓜供試樣品DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，100μL ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②SSR引物合成和PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)446對(duì)SSR引物由北京市農(nóng)林科學(xué)院許勇研究員團(tuán)隊(duì)提供，由上海生工生物工程公司合成。

PCR反應(yīng)10μL體系：DNA模板（30 mg·L-1）1μL，上游引物（10μmol·L-1）0.5μL，下游引物（10μmol·L-1）0.5μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）1.0μL，dNTP（25 mmol·L-1）0.15μL，TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.1μL，ddH2O 6.75μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

退火溫度確定：根據(jù)設(shè)計(jì)的退火溫度作篩選，若結(jié)果偽帶、雜帶較多可適當(dāng)提高退火溫度，若條帶較淡或空白可適當(dāng)降低退火溫度。

③電泳

PCR產(chǎn)物中加入2.5μL10×Loading Buffer，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，恒壓200 V，電泳2 h，使用銀染法染色并拍照記錄數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

讀取擴(kuò)增后清晰條帶，在相同遷移位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“-”，不同引物擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)成原始的“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣。將田間已測(cè)定果實(shí)性狀輸入Microsoft Excel 2019軟件，并計(jì)算各性狀平均值、標(biāo)準(zhǔn)差。頻率分布在SPSS 22軟件中完成。運(yùn)用Popgen 32軟件計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，利用PIC-CALCVer-sion 0.6軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）值，利用軟件NTSYS-pc 2.10，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA），對(duì)供試材料作聚類分析。利用TASSEL 5.0軟件中GLM一般線性模型將81份西瓜種質(zhì)資源表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)結(jié)合后，開展全基因組關(guān)聯(lián)分析。

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜農(nóng)藝性狀表型分析

頻率分布直方圖見圖1。結(jié)果表明，果實(shí)重量頻率變化為1.00~13.80 kg，果實(shí)長(zhǎng)度頻率變化為12.00~35.00 cm，果實(shí)寬度頻率變化為10.60~32.30 cm，果皮厚度頻率變化為0.30~4.00 cm，中心果肉可溶性固形物含量頻率變化為2.00~12.50，近皮果肉可溶性固形物含量頻率變化為1.60~11.60，種子長(zhǎng)度頻率變化為7.74~12.51 mm，種子寬度頻率變化為4.37~10.52 mm，種子厚度頻率變化為1.54~3.89 mm，9個(gè)表型性狀符合正態(tài)分布。變異系數(shù)主要反映某一性狀數(shù)值，9個(gè)表型性狀變異情況見表2，果實(shí)重量和果皮厚度變異系數(shù)最大，均為48%，果實(shí)寬度變異系數(shù)最小，為17%。按變異系數(shù)可將西瓜9個(gè)表型性狀變異程度分為小（CV≤25%）、中（25%

表2 西瓜9個(gè)農(nóng)藝性狀表型分析Table 2 Phenotypic analysis of nine agronomic traits in watermelon

圖1 9個(gè)西瓜表型性狀頻次直方圖Fig.1 Histogram for the nine watermelon phenotypic traits

2.2 SSR引物篩選及多態(tài)性分析

運(yùn)用446對(duì)SSR引物對(duì)16份具有代表性西瓜種質(zhì)材料作擴(kuò)增，篩選出110對(duì)帶型清晰、多態(tài)性高SSR引物，覆蓋西瓜11條染色體，每條染色體均分布10對(duì)引物，占總引物數(shù)24.7%。再用110對(duì)SSR引物對(duì)81份種質(zhì)材料作基因分型。經(jīng)PCR擴(kuò)增后DNA片段長(zhǎng)度為100~330 bp，共計(jì)得到清晰可辨認(rèn)條帶8 250條，這些引物對(duì)所有種質(zhì)材料擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性豐富、條帶清晰且特異性高。110對(duì)引物多態(tài)性分析結(jié)果見表3。

表3 110對(duì)SSR引物多態(tài)性信息Table 3 Polymorphism of 110 pairs of SSR primers

在81份西瓜種質(zhì)材料中共檢測(cè)到335個(gè)等位基因，等位基因數(shù)變化為2~8個(gè)，平均為3.4個(gè)。其中BVWS00209等位基因數(shù)最多（8個(gè)）。有效等位基因數(shù)變化為1.17~5.53，平均為1.97。（PIC）值變化為0.25~0.80，平均為0.40，其中，BVWS00209多態(tài)性最高，為0.80。觀測(cè)雜合度變幅為0.32~1.00，平均為0.93。Shannon信息指數(shù)變幅變化為0.28~1.58，平均為0.76。綜合數(shù)據(jù)指標(biāo)表明110對(duì)SSR引物多態(tài)性良好，有效揭示81份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性。

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

2.3 聚類分析

利用NTSYS-pc2.10軟件，以遺傳相似系數(shù)采用UPGMA方法聚類（見圖2）。結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為0.68時(shí)，81份西瓜種質(zhì)材料可分為兩大類群。第一類群包括69份西瓜種質(zhì)材料，均為西瓜種（C.lanatus）。第二類群共12份西瓜種質(zhì)材料，包括8份毛西瓜變種（C.lanatus var.lanatus）、2份藥西瓜種（C.colocynthis）、1份飼用西瓜變種（C.lanatus var.citroides）、1份熱迷西瓜種（C.rehmii），因此根據(jù)進(jìn)化樹節(jié)點(diǎn)位置細(xì)分，又可將第二類群分為3個(gè)亞群，第一亞群將熱迷西瓜種Grif16135單獨(dú)聚為一類，第二亞群將2份藥西瓜種PI532738和PI179881聚為一類，第三亞群將8份毛西瓜變種PI296341、PI500308、PI482362、綠子砧木西瓜、PI271775、PI 459074、PI482255、PI508443和1份飼用西瓜變種PI482322-1聚為一類。

圖2 81份西瓜種質(zhì)資源聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 81 watermelon germplasm resources

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.0軟件中GLM一般線性模型，將110對(duì)SSR標(biāo)記與81份西瓜種質(zhì)資源9個(gè)表型性狀作全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到與西瓜種質(zhì)資源9個(gè)表型性狀關(guān)聯(lián)SSR標(biāo)記109個(gè)，根據(jù)Bonferroni檢驗(yàn)，P0.05=0.05/335=0.00014925，P0.01=0.01/335=0.00002985，分別取負(fù)對(duì)數(shù)為3.826和4.525，將p≤10-5（-LogP≥3.826）作為關(guān)聯(lián)分析中標(biāo)記與性狀之間顯著關(guān)聯(lián)閾值，全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4。所檢測(cè)到109個(gè)SSR標(biāo)記中，有5個(gè)標(biāo)記與3個(gè)農(nóng)藝性狀顯著關(guān)聯(lián)，BVWS00589、BVWS00209與果皮厚度相關(guān)，分別位于4號(hào)和9號(hào)染色體（見圖3）。BVWS00544、BVWS02384與中心果肉可溶性固形物含量相關(guān)，分別位于11號(hào)和6號(hào)染色體（見圖4）。BVWS00807與種子厚度相關(guān)，位于4號(hào)染色體（見圖5）。

圖3 果實(shí)厚度曼哈頓圖Fig.3 Manhattan plot of fruit thickness

圖4 中心果肉可溶固形物含量曼哈頓圖Fig.4 Manhattan plot of soluble solids content in central pulp

圖5 種子厚度曼哈頓圖Fig.5 Manhattan plot of seed thickness

表4 西瓜3個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)SSR標(biāo)記Table 4 SSR markers of three traits in watermelon were significantly associated

3 討論與結(jié)論

3.1 背景選擇標(biāo)記篩選

分子標(biāo)記輔助背景選擇關(guān)鍵是獲得在基因組上分布相對(duì)均勻且數(shù)量充足的分子標(biāo)記，由于隨背景選擇標(biāo)記數(shù)增加，在準(zhǔn)確度增加同時(shí)試驗(yàn)成本也大幅增加，因此，針對(duì)特定植物材料和選擇時(shí)期，需確定適宜數(shù)量的背景選擇標(biāo)記[11]。Hospi?tal等研究表明全基因組背景選擇需適宜標(biāo)記數(shù)為每100 cM 2~3個(gè)標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上增加標(biāo)記數(shù)，效果并不顯著[17]。劉基生等在甘藍(lán)背景選擇中使用標(biāo)記密度為平均每條染色體9.8個(gè)[11]。夏軍紅等在玉米背景選擇中使用標(biāo)記密度為平均每條染色體7.1個(gè)[18]。本研究在西瓜11條染色體上均分布10個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記數(shù)量較為適宜，可用于西瓜背景選擇工作。

3.2 西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

SSR標(biāo)記因其自身優(yōu)點(diǎn)，廣泛適用于種質(zhì)材料遺傳多樣性分析[19]。Wang等通過SSR標(biāo)記分析61份西瓜材料遺傳多樣性，結(jié)果表明引物多態(tài)性在供試種質(zhì)資源間差異較大且栽培品種多態(tài)性普遍較低[20]。石磊等用31對(duì)SSR引物分析50份西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性，等位基因數(shù)平均為1.46個(gè)，Shannon多樣性信息指數(shù)平均為0.73[21]。徐彥剛等利用45對(duì)SSR引物分析78份西瓜種質(zhì)材料遺傳多樣性，平均等位基因數(shù)1.98，平均PIC值0.41[22]。本研究遺傳多樣性分析結(jié)果高于易麗聰?shù)鹊玫降钠骄銤庑畔⒅笖?shù)0.43和平均PIC值0.23[23]。低于王準(zhǔn)等得到的平均等位基因數(shù)6.05個(gè)和平均PIC值0.49[24]，高于趙勝杰等得到的平均PIC值0.31[25]。本研究在西瓜全基因組開發(fā)的446對(duì)SSR引物中篩選出110對(duì)引物，多態(tài)性信息含量（PIC）變化為0.25~0.80，平均0.40，篩選的SSR引物多態(tài)性較高，但與前人開發(fā)的西瓜23對(duì)核心引物對(duì)比，部分引物多態(tài)性較低，可能因選取的供試材料以西瓜種居多，且大多數(shù)為栽培種，僅少數(shù)為野生種，說明SSR引物多態(tài)性不僅受引物特性限制，還可能與群體大小、種類、標(biāo)記數(shù)量有關(guān)。雖然西瓜已篩選出23對(duì)核心引物并有效用于西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，但背景選擇需在每條染色體上分布充足且相對(duì)均勻的標(biāo)記才可開展，所以本研究在全基因組開發(fā)標(biāo)記中，初步建立一套分布廣且多態(tài)性高標(biāo)記作為西瓜背景選擇標(biāo)記。

3.3 遺傳多樣性分析

程莉莉等利用26對(duì)SSR引物對(duì)383份玉米種質(zhì)材料作聚類分析，將供試材料分為6大類[26]。本研究聚類分析結(jié)果表明，81份西瓜種質(zhì)被分為兩大類群，大部分西瓜種質(zhì)材料被劃分到第一類群中，均為西瓜種，說明西瓜種間親緣關(guān)系較近。藥西瓜種與熱迷西瓜種、毛西瓜變種、飼用西瓜變種被劃分到第二類群中，說明其親緣關(guān)系較近，且兩群體親緣關(guān)系明顯較遠(yuǎn)。通過聚類分析表明，供試材料在分子水平分類結(jié)果與西瓜屬分類存在一定相關(guān)性。同時(shí)，猜測(cè)這兩大類群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的原因可能是第一類群中西瓜材料多為栽培種，第二類群西瓜材料多為野生種所致。

3.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究檢測(cè)到與果皮厚度顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記2個(gè)，分別位于4號(hào)和9號(hào)染色體，檢測(cè)到與中心果肉可溶性固形物含量顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記2個(gè)，分別位于6號(hào)和11號(hào)染色體，檢測(cè)到與種子厚度顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記1個(gè)，位于4號(hào)染色體上，與郭祿芹對(duì)西瓜全基因組作關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致[27]。程瑤利用花園母本和LSW-177構(gòu)建重組自交系作QTL分析，共檢測(cè)到控制可溶性糖含量5個(gè)QTL，分布在2號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)連鎖群上[28]；周慧文等利用PI186490和LSW-177構(gòu)建F2群體，對(duì)種子大小作QTL分析，檢測(cè)到與種子厚度相關(guān)QTL 2個(gè)，分別位于3號(hào)和6號(hào)連鎖群[29]。比較發(fā)現(xiàn)，通過QTL定位到的QTL位點(diǎn)與本研究關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到標(biāo)記結(jié)果存在差異，原因可能是環(huán)境條件不同，如生長(zhǎng)時(shí)期澆水量、光照、溫度等變化影響西瓜糖含量形成和植物各器官發(fā)育，表型測(cè)定準(zhǔn)確性也對(duì)關(guān)聯(lián)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。另一方面，可能與試驗(yàn)群體有關(guān)，多數(shù)研究者選擇F2或重組自交系，而本試驗(yàn)選用自然群體，自然群體中個(gè)體間親緣關(guān)系或亞群結(jié)構(gòu)影響均可能造成關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的差異。