胡潔芳

(江西工業(yè)貿易職業(yè)技術學院，南昌 330038)

在眾多飼料安全問題中，獸藥殘留一直是影響飼料安全的最主要因素之一。獸藥在促進動物生長、預防和治療動物疾病、控制動物繁殖等方面起著重要作用。由于我國在獸藥的使用和管理上存在很多問題，致使動物性產(chǎn)品中獸藥殘留超標事件屢屢發(fā)生，嚴重影響了人們的身體健康和我國動物性產(chǎn)品的出口貿易。目前對人畜危害較大的獸藥主要包括抗生素類、磺胺類、硝基呋喃類、抗寄生蟲類及激素類等藥物。其中硝基呋喃類藥物因具有殺菌能力強、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價格低廉、療效好等優(yōu)點，曾經(jīng)在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應用[1-3]。

呋喃妥因是硝基呋喃類獸藥的一種，殺菌能力強、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價格低廉、療效好，在臨床上得到了廣泛應用，主要用于雞白痢、雞大腸桿菌病、雞球蟲病等各種腸道感染性疾病的治療及用作豬、禽類和水產(chǎn)促生長的添加劑。有關研究證明，大劑量或長時間使用呋喃它酮原藥能對養(yǎng)殖動物有毒性作用，表現(xiàn)為厭食、腹瀉、胃腸出血、周圍神經(jīng)炎、興奮、驚厥、癱瘓等，嚴重還會導致死亡。呋喃妥因及其代謝物AHD還能夠誘導有機體基因突變及致畸胎且能夠誘發(fā)癌癥[4-5]。

目前關于呋喃妥因及其代謝物AHD殘留監(jiān)測常用的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、液相-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[7]和免疫分析方法[8]。本研究采用高效液相色譜法對豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留進行檢測，并對色譜條件和樣品前處理條件進行優(yōu)選，在最優(yōu)的色譜條件和樣品前處理條件基礎上建立豬肉中AHD殘留的高效液相色譜檢測方法并對建立的方法進行一系列的方法學評價，為動物性食品中呋喃妥因原藥和代謝物AHD殘留監(jiān)控提供理論基礎，具有很好的應用前景。

1 試驗材料和儀器

1.1 試驗材料

豬肉，購買于農(nóng)貿市場；鄰硝基苯甲醛，氫氧化鈉，三水合磷酸氫二鉀，吐溫-20，二甲基亞砜，冰乙酸，鹽酸等均為分析純；無水甲醇，乙腈為色譜純（天津市永大化學試劑開發(fā)中心）；AHD標準品和NPAHD標準品（美國Sigma公司）。

1.2 主要儀器

Waters2487高效液相色譜儀（美國Waters公司），TDL-5-A低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠），RE-52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮有限公司生化儀器廠），pHS-3C pH計（上海雷磁儀器廠）等。

2 試驗方法

2.1 試劑配制

①PBS：0.05g磷酸二氫鉀，0.725g十二水磷酸氫二鈉，2g氯化鈉，0.05g氯化鉀溶于250mL容量瓶中。

②PBST：取50mLPBS和25μL吐溫-20混合于小燒杯中，并用保鮮膜封口。

③2mg/mL呋喃妥因母液：準確稱取呋喃妥因標準品，并用二甲亞砜作為溶劑配成2mg/mL濃度的母液。

2.2 樣品處理

取1.0g均質樣品于50mL離心管中，加入4mL蒸餾水，0.5mL 1mol/mL鹽酸和400μL 10 mmol/L 2-硝基苯甲醛，充分振蕩30 s，然后用錫箔紙進行包裹，置于37℃水浴中恒溫振蕩16h，取出冷卻后加入5mL 0.1mol/mL磷酸氫二鉀，用1mol/L的氫氧化鈉調節(jié)至合適的pH，再加5mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，于4500g離心10min，取出乙酸乙酯層于旋轉蒸發(fā)瓶蒸發(fā)至干，用3mL正己烷溶解干燥物,加1mL 0.01mol/mL PBST適當?shù)幕旌?，在室溫?500 g離心10 min，下層液體用0.45μm濾頭過濾后進行高效液相色譜檢測。

2.3 參考色譜條件

本實驗參考了GB/T 20752-2006豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定的色譜條件[9]，其色譜條件如下：色譜柱：Atlantis-C18,3.5μm,150mm×2.1mm； 柱 溫：35℃；進樣量：40μL；梯度洗脫程序（見表1）：

表1 國標色譜梯度洗脫程序

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于本實驗使用的色譜柱同參考的國標方法所用的色譜柱型號不同，為Symmerry-C18（5μm,4.6×250mm），在預實驗中發(fā)現(xiàn)參考的國標的色譜條件對此色譜柱不合適，需要對柱溫，流速，流動相等色譜條件進行優(yōu)化，從而得到在此色譜柱條件下測定呋喃妥因代謝物AHD殘留的最佳色譜測定條件。

2.3.2 柱溫

本實驗選擇20℃，25℃，30℃，35℃，40℃五個柱溫對同一個樣品進行高效液相色譜測定，考察不同柱溫對樣品峰分離效果的影響，從而選出最優(yōu)柱溫進行后續(xù)實驗[9-10]。

2.3.3 流速

流速對高效液相色譜測定樣品出峰時間和分離效果會有一定的影響，本實驗中選擇0.2mL/min，0.4mL/min，0.5mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min五個流速對同一個樣品進行高效液相測定，探究不同流速對NPAHD峰分離效果的影響，從而選出最優(yōu)流速進行后續(xù)實驗[9-12]。

2.3.4 流動相pH

由于流動相的酸度對NPAHD峰分離效果有一定的影響，參考國標中0.3%乙酸水的酸度比較大（pH約為3），考慮到流動相酸度過高對色譜柱和液相色譜儀有較大腐蝕作用，為保護所使用的色譜柱和儀器，希望在更低的酸度條件下進行實驗也能得到較好的分離效果，所以本實驗選擇pH=3.0，pH=4.0，pH=5.0三個流動相酸度來進行液相色譜測定，探究流動相不同酸度對NPAHD分離效果的影響，從而找出最優(yōu)流動相pH。

2.4 樣品預處理條件的優(yōu)化

2.4.1 甲醇水處理對NPAHD提取影響

彭濤等人[10]發(fā)現(xiàn)樣品在酸解之前加入甲醇水處理樣品能夠有效的去除樣品中的雜質，有利于后續(xù)NPAHD的提取，但大部分文獻都沒有做這一步處理，所以本實驗設置了酸解前加甲醇水處理和不加甲醇水處理兩組實驗，考察酸解前加甲醇水處理對NPAHD提取效果的影響。

2.4.2 衍生液PH對乙酸乙酯提取NPAHD的影響

樣品衍生16h后衍生液pH對乙酸乙酯提取NPAHD有一定的影響，本實驗選擇了pH=6.0，pH=6.5，pH=7.0，pH=7.5四個衍生液酸度梯度，考察衍生液不同pH對后續(xù)乙酸乙酯提取NPAHD的影響，每個pH做兩個平行樣，從而選出最優(yōu)衍生液pH來進行后續(xù)添加回收的實驗測定。

2.5 NPAHD標準曲線的建立

取2mg/mL NPAHD標準儲備液，用PBS稀釋至1μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05 μg/mL等濃度，按前述優(yōu)選好的色譜條件進樣液相色譜測定，每個濃度做兩個平行測定，以濃度作為橫坐標，峰面積作為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程和相關系數(shù)。

2.6 精密度試驗

用3個不同濃度的標準NPAHD溶液在前述優(yōu)選好的色譜條件下，連續(xù)進樣5次，對得到的峰面積進行差異分析，計算標準差(SD)和變異系數(shù)（CV），確定方法的精密度。得到的變異系數(shù)越小，方法的精密度越高。按下面公式計算標準差和變異系數(shù)：

式中：X為n次重復測定的算術平均值；Xi為n次測定中的一次；n為重復測定的次數(shù)。

2.7 添加回收率試驗

稱取均質好的1g豬肉樣品，分別加入1mL配 制 好 的0.2μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL的AHD標準品，加入4mL蒸餾水，0.5mL 1mol/mL鹽酸和400μL 10mmol/mL 2-硝基苯甲醛，充分振蕩30 s，置于37℃水浴中恒溫振蕩16h，取出冷卻后加入5mL 0.1mol/mL磷酸氫二鉀，用1mol/mL氫氧化鈉溶液調到最適pH，5mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，于4500g離心10min，取出乙酸乙酯層于旋轉蒸發(fā)瓶蒸發(fā)至干，用3mL正己烷溶解干燥物,加1mL 0.01mol/mL PBST適當?shù)幕旌?，在室溫?500g離心10min，下層液體用0.45μm濾頭過濾后進行高效液相色譜檢測。每個樣本做2個平行實驗，根據(jù)NPAHD檢測結果得到AHD回收檢出量，計算方法的添加回收率。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)選

3.1.1 柱溫的選擇（見圖1）

圖1 不同柱溫對NPAHD分離效果的影響

本實驗設置了40℃，35℃，30℃，25℃，20℃五個柱溫進行高效液相色譜測定，結果如圖1所示。從圖1可知柱溫為40℃時峰型和分離效果都不是很好，而35℃，30℃，25℃，20℃時的柱溫圖形都差不多，但NPAHD都沒有完全拉開，因為柱溫較高時影響色譜柱的壽命，所以最終選擇30℃作為色譜柱溫的條件，通過改變其他色譜條件來使NPAHD達到分離。

3.1.2 流速的選擇（見圖2）

流速對于出峰時間和色譜峰分離效果影響較 大，本 實 驗 設 置 了0.2mL/min、0.4mL/min、0.5 mL/min、0.6mL/min、0.8mL/min5個流速梯度進行實驗，結果如圖2所示。從圖2可以看出流速越慢，出峰時間也越慢，流速加大，出峰時間縮短，當流速在0.2和0.4mL/min時NPAHD峰沒有分開，流速在0.5mL/min時峰型和分離效果最好，流速在0.8mL/min時NPAHD峰雖然也分開了，但峰形不好且在0.8mL/min流速時柱壓偏大，綜合考慮以上因素，選擇了0.5mL/min作為最佳流速進行后續(xù)實驗。

圖2 不同流速對NPAHD分離效果的影響

3.1.3 流動相乙酸水pH的選擇（見圖3）

圖3 不同流動相pH對NPAHD分離效果的影響

根據(jù)參考文獻，其所用的乙酸水流動相pH在3左右，本實驗考慮到高酸性的流動相對實驗儀器和色譜柱有一定的腐蝕作用，且用參考流動相做預實驗時發(fā)現(xiàn)分離效果也不好，所以設置了pH=3，pH=4，pH=5的三個酸度梯度，結果如圖3所示。由圖3可知，pH=5時，NPAHD峰完全沒有和其它峰分開，pH=3和pH=4時，峰型和分離效果都較好，因為考慮到流動相低酸度時有利于保護色譜儀和色譜柱，所以本實驗選擇了乙酸水pH=4作為最佳流動相pH。

3.2 樣品前處理條件的優(yōu)選

3.2.1 甲醇水處理對NPAHD提取效果的影響（見圖4）

圖4 樣品加酸水解前加甲醇水對NPAHD提取分離效果的影響

從彭濤等人[10]實驗中了解到，樣品在酸解前加入甲醇水，并離心去除上清液，能夠除去樣品中的一些雜質，讓結果更加準確，但根據(jù)本試驗圖4結果可知加入甲醇水后的色譜圖與沒加甲醇水的色譜圖型基本一樣，NPAHD峰面積差別不大，沒有什么效果，所以為了簡化實驗步驟，我們選擇不加甲醇水處理樣品，而是直接進行酸解并離心，然后進行后續(xù)實驗。

3.2.2 衍生液pH的選擇（見圖5）

樣品經(jīng)過酸解衍生16h后用磷酸二氫鉀和氫氧化鈉對樣品pH進行調節(jié)，衍生液不同pH對后續(xù)NPAHD的提取有一定的影響，所以本實驗設置了4個pH梯度6.0，6.5，7.0，7.5來進行優(yōu)選，結果如圖5所示。從圖5結果發(fā)現(xiàn)pH在7.0時的峰面積、峰型和分離效果較其他pH更好，所以本實驗選擇了將衍生液pH調至7.0時做為最優(yōu)衍生液pH進行后續(xù)實驗。

圖5 衍生液不同pH對乙酸乙酯提取NPAHD效果的影響

3.3 NPAHD標準曲線（見圖6）

圖6 NPAHD標準曲線

以NPAHD濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制的標準曲線，得到的標準曲線見圖6，線性回歸方程為y=35648x-442.84，相關系數(shù)R2=0.9985。

3.4 精密度試驗（見表2）

由表2知，本實驗的變異系數(shù)均小于6%，說明本實驗建立的高效液相色譜法精密度較好。

表2 高效液相色譜法的精密度

3.5 添加回收試驗

采用本實驗建立的高效液相色譜法進行豬肉樣品添加AHD標樣的添加回收實驗，計算4個濃度加標樣品中的標準偏差（CV）和本方法的添加回收率，對本實驗建立的高效液相色譜法檢測實際樣品的能力進行評價。從表3可知，高效液相色譜法的加標回收率范圍為81%~95%，符合方法建立的加標回收率要求。

表3 高效液相色譜法對豬肉中AHD添加回收率(n=2)

4 討論

本實驗使用的色譜柱和國標GB/T 20752-2006所用的色譜柱的型號不同，在預實驗中發(fā)現(xiàn)參考的國標的色譜條件對此色譜柱不合適，需要對柱溫，流速，流動相等色譜條件重新進行優(yōu)化，使得NPAHD能得到良好分離，從而得到在此色譜柱條件下測定呋喃妥因代謝物的衍生物NPAHD殘留的最佳色譜測定條件。從色譜條件優(yōu)選實驗結果可知，色譜柱溫在40℃時峰型和分離效果最差，其它溫度條件下效果相差不大，也沒有完全分開，流速過高或過低都影響了NPAHD出峰效果，流速在0.5mL/min時峰型和分離效果最好，流動相乙酸水的pH不同對結果也產(chǎn)生了較大的影響，在其pH=4時，效果最好。所以本實驗選擇了柱溫30℃，流速0.5mL/min，pH=4的乙酸水-乙腈流動相作為最佳色譜條件。

在上述優(yōu)選確定了的色譜條件下再對樣品前處理的一些條件進行優(yōu)選。由于樣品酸解前甲醇水處理和樣品酸解衍生16h后的衍生液pH對NPAHD提取有一定影響，所以本實驗針對這兩個前處理條件進行優(yōu)選。結果發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)甲醇水處理后，NPAHD的提取效果并沒有得到提高，而衍生液pH為7的樣品經(jīng)高效液相檢測出的NPAHD的峰型、分離效果和峰面積最好。所以我們將甲醇水處理這一操作步驟去除，簡化實驗，并且將衍生液pH調至7作為樣品前處理的優(yōu)選。

然后在最佳的前處理和最佳的色譜條件下對精密度和添加回收率進行測定，通過精密度和添加回收率的數(shù)據(jù)來評價本實驗建立的NPAHD高效液相色譜測定方法。精密度實驗變異系數(shù)均小于6%，添加回收實驗回收率范圍為81%～95%，可知精密度和添加回收率實驗結果都符合要求，說明建立的高效液相色譜法可以用于豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留的檢測。

從本試驗我們得到的經(jīng)驗是在借鑒相關文獻和方法時切忌盲目搬抄，應該具體問題具體分析。本實驗因為色譜柱型號和參考文獻不一致，所以需要對所用的色譜條件和前處理條件重新進行優(yōu)選，得出最適合自己的色譜條件和前處理條件來建立合理可靠的高效液相色譜檢測方法。

5 結論

(1)本試驗優(yōu)化的色譜條件為柱溫30℃，流速0.5mL/min，流動相為pH=4.0的乙酸水溶液（A）和乙腈(B)，梯度洗脫時間、乙酸水溶液和乙腈配比參考國標（見表1），提高了測定結果的準確度。

(2)本試驗優(yōu)化的前處理條件為加酸酸解衍生前不加甲醇水，乙酸乙酯提取前調衍生液pH＝7.0，提高了前處理的效率。

(3)在優(yōu)化的色譜條件和預處理條件下建立測定NPAHD的標準曲線，計算得到其線性回歸方程為y=35648x-442.84，相關系數(shù)R2=0.9985；本試驗建立的高效液相色譜法精密度實驗的平均相對標準偏差均小于6%；高效液相色譜法添加回收率范圍為81%～95%，說明建立的高效液相色譜法可用于豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留的檢測。