劉子歌，張 晨，宋國瑞，王 強，郭高鵬，陳德勝

人工關節(jié)無菌性松動是全關節(jié)置換術的主要并發(fā)癥之一，其主要是由于體內破骨細胞和成骨細胞對磨損顆粒的生物學反應導致的。限制假體周圍骨溶解的方法大多專注于抑制假體周圍炎癥和破骨細胞形成。最新的研究表明成骨細胞在這個過程中也發(fā)揮了重要的作用[1-3]。骨祖細胞和骨髓間充質干細胞都可以分化為成骨細胞，它們與假體周圍磨損顆粒的相互作用對于人工假體的初始骨整合和假體周圍骨的長期形成都是十分重要的。有研究表明，磨損顆粒還可以通過破壞骨祖細胞和間充質干細胞的成骨潛能來促進骨溶解[4]。由于骨重建依賴于成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間的平衡，抑制成骨細胞的產生可以使平衡向加速溶骨的方向傾斜。紅霉素是一種十四元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素，用于治療感染性疾病已有50多年的歷史，具有良好的抗炎作用。Kudoh等[5]在1998年就證明了紅霉素可以用于彌漫性全細支氣管炎的抗炎治療。還有研究表明，紅霉素通過抑制NF-κB信號轉導通路而發(fā)揮抗炎作用[6]。本課題組的前期研究顯示NF-κB在磨損顆粒誘導的炎性骨溶解中有重要作用，鑒此認為紅霉素是治療人工關節(jié)置換術后假體無菌性松動的潛在候選藥物[7]。本研究旨在探討紅霉素對聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)磨損顆粒刺激下MC3T3-E1細胞成骨作用的影響及其潛在的機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 MC3T3-E1細胞，由中南大學湘雅醫(yī)院運動系統(tǒng)損傷與修復研究中心贈送。PMMA磨損顆粒，由日本島根大學附屬醫(yī)院矯形外科贈送，直徑均<10 μm，按本課題組的前期方法進行處理并檢測內毒素，確保能用于后續(xù)實驗[8]。α-MEM培養(yǎng)基、DMSO、胎牛血清購自美國Gbico公司。紅霉素購自美國MCE公司，純度>99.00%。β-甘油磷酸鈉(sodium β-glycerophosphate)、L-抗壞血酸(L-ascorbic acid)購自美國Apexbio公司。鱟內毒素檢測試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、堿性磷酸酶檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara生物公司。

1.2成骨細胞培養(yǎng)及分組方法 取MC3T3-E1細胞解凍復蘇，離心棄上層凍存液，以含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基進行重懸，于培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，培養(yǎng)基成分為含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基+10 mM β-甘油磷酸鈉+50 μg/ml L-抗壞血酸。在添加PMMA磨損顆粒(1 mg/ml)之前，采用不同濃度(0.0 μg/ml、0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml)的紅霉素對MC3T3-E1細胞進行預處理2 h；以未經PMMA和紅霉素處理的MC3T3-E1細胞作為空白對照組。每個處理組做3個復孔，每3 d更換細胞培養(yǎng)基。

1.3MC3T3-E1細胞增殖活性檢測方法 應用乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒對MC3T3-E1細胞的乳酸脫氫酶進行檢測，以反映細胞增殖活性。收集經PMMA磨損顆粒(1 mg/ml)與不同濃度紅霉素干預組處理72 h后的上清培養(yǎng)液，各組取100 μl培養(yǎng)基至96孔板中，與100 μl的工作溶液混合，避光室溫孵育30 min。采用E2500全波長自動酶標儀檢測各孔490 nm的吸光度值。細胞增殖活性(%)=(干預組吸光度-空白對照組吸光度)/(細胞最大酶活性的吸光度-空白對照組吸光度)×100%。

1.4MC3T3-E1細胞成骨活性檢測方法 應用堿性磷酸酶檢測試劑盒對MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶進行檢測，以反映細胞成骨活性。按照分組處理細胞，MC3T3-E1細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，以4 ℃磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)輕輕沖洗2遍，RIPA裂解細胞，離心，收集細胞裂解蛋白產物。嚴格按照試劑盒說明書配置標準樣品，設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔，在37 ℃生物孵育箱中孵育30 min。每孔加入100 μl終止液，使用E2500全波長自動酶標儀檢測各孔405 nm的吸光度值。

1.5實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測方法 按照分組處理細胞，MC3T3-E1細胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，應用Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA試劑盒將總RNA逆轉錄合成cDNA。應用Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒進行RT-PCR，測定目的基因的轉錄水平，所用引物由上海生工生物科技有限公司設計并合成，序列見表1。以2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。

表1 引物序列

2 結果

2.1各處理組MC3T3-E1細胞增殖活性比較 與空白對照組比較，其他處理組MC3T3-E1細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明本實驗所設置紅霉素和PMMA顆粒濃度條件對MC3T3-E1細胞的增殖活性沒有造成影響。見圖1。

圖1 各處理組MC3T3-E1細胞增殖活性圖

2.2各處理組MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶濃度比較 與空白對照組相比，經PMMA處理組的細胞堿性磷酸酶濃度均顯著降低(P<0.05)。而加入濃度為0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml紅霉素進行干預后，細胞堿性磷酸酶濃度升高，呈劑量依賴性，且PMMA+1.0 μg/ml紅霉素組、PMMA+5.0 μg/ml紅霉素組、PMMA+10.0 μg/ml紅霉素組的細胞堿性磷酸酶濃度均顯著高于PMMA組(P<0.05)。見圖2。

與空白對照組比較，#P<0.05；與PMMA組比較，*P<0.05圖2 各處理組MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶濃度比較圖

2.3各處理組MC3T3-E1細胞成骨基因表達水平比較 與空白對照組相比，PMMA組Runx2、Osterix、OCN的表達水平均顯著降低(P<0.05)，而p65表達水平顯著增高(P<0.05)。經0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細胞p65表達水平較PMMA組顯著降低(P<0.05)。經1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細胞Runx2、OCN表達水平較PMMA組顯著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml紅霉素處理后MC3T3-E1細胞Runx2、OCN表達水平與PMMA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。經5.0 μg/ml和10.0 μg/ml紅霉素處理后，MC3T3-E1細胞Osterix表達水平較PMMA組顯著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml、1.0 μg/ml紅霉素處理后MC3T3-E1細胞Osterix表達水平與PMMA組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。紅霉素干預對Runx2、Osterix、OCN和p65表達水平的恢復均呈劑量依賴性。見表2。

表2 各處理組MC3T3-E1細胞成骨基因表達水平比較

3 討論

3.1人體內骨轉換是由破骨細胞性骨吸收和成骨細胞性骨形成之間的微妙平衡決定的。雖然激活的巨噬細胞和活化的破骨細胞是假體周圍骨溶解中骨破壞的主要因素，但磨損顆粒對成骨細胞的影響也會顯著降低假體界面處的骨形成。有研究表明，磨損顆粒還會影響骨祖細胞的增殖、成熟和分化，通過減少骨形成促進骨溶解過程[9]。許多類型的人工關節(jié)假體磨損顆粒會對成骨細胞的活性、增殖能力和功能產生影響，如鈦顆粒、超高分子量聚乙烯、陶瓷顆粒和PMMA磨損顆粒等[10-11]。本研究結果提示，紅霉素干預處理后可顯著降低PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞骨生成的抑制作用。

3.2Chiu等[12]報道PMMA磨損顆?？梢种芃C3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性，且呈劑量依賴性。本研究結果也顯示，1 mg/ml的PMMA磨損顆粒即可對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶的濃度產生明顯的抑制作用，而紅霉素干預可減輕PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶造成的影響。OCN是成骨細胞終末分化的標志物[13]。本研究結果提示紅霉素對PMMA磨損顆粒誘導的OCN基因表達下調有一定的緩解作用。另外，成骨細胞分化還受到轉錄因子Runx2和Osterix的調控[14-15]。Runx2可調節(jié)成骨細胞關鍵蛋白的表達，如堿性磷酸酶和OCN。在成熟的成骨細胞中，Osterix位于Runx2的下游。本研究發(fā)現紅霉素干預可改善PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞造成的Runx2和Osterix表達下調。然而PMMA磨損顆粒對成骨細胞的作用機制尚不十分清楚。

3.3目前，已有許多研究證實了NF-κB信號通路對破骨細胞形成的作用，但其對成骨細胞和骨形成的作用仍不明確[16-19]。本研究結果顯示，PMMA磨損顆粒干預可顯著增加MC3T3-E1細胞NF-κB信號通路中p65的表達。PMMA磨損顆粒誘導NF-κB信號通路活化的機制可能是多因素的。本研究發(fā)現，0.2 μg/ml的紅霉素即可改善PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞的刺激作用，降低p65的表達水平。因此推測紅霉素是通過抑制NF-κB信號通路而緩解PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞Runx2和Osterix的下調作用，從而部分恢復堿性磷酸酶濃度。NF-κB信號通路激活與慢性炎癥、自身疾病以及癌癥密切相關[20]。筆者認為紅霉素的抗炎作用可以在一定程度上減少炎癥細胞因子對成骨細胞和成骨細胞前體的抑制作用，這部分是通過抑制NF-κB信號通路的激活來實現的。但是需要更多的實驗證明成骨細胞和成骨細胞前體中NF-κB信號轉導與Runx2信號轉導之間的相互作用。

綜上所述，紅霉素干預可減輕PMMA磨損顆粒對MC3T3-E1細胞分化的抑制作用，其作用機制可能是通過抑制NF-κB信號通路來實現的。但是對于其他類型的磨損顆粒，紅霉素是否依然能夠展現出相似的作用仍有待進一步研究。紅霉素可能是改善骨水泥相關假體的骨溶解和無菌性松動的一種潛在治療藥物。