王軟林 肖 羽 李 佳 梁愛華

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實驗室, 太原 030006)

微管蛋白(Tubulin)是真核生物中含量最豐富的蛋白質(zhì), 是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分, 在細(xì)胞分裂、胞內(nèi)運(yùn)輸及纖毛和鞭毛運(yùn)動等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。真核生物的微管蛋白由多個高度保守的亞家族組成[1]。α、β和γ微管蛋白廣泛存在于所有的真核生物中, 早期被認(rèn)為是該蛋白家族中僅有的成員[2]。α微管蛋白和β微管蛋白以異二聚體形式頭尾相連形成線性原絲, 是組成微管的基本模塊。γ微管蛋白是微管組成中心(Microtubule organizing center, MTOC)的組成成分, 在微管組裝的成核過程中發(fā)揮重要作用。在隨后的研究中微管蛋白家族新成員不斷被發(fā)現(xiàn)[3], 通過遺傳突變的方法, 分別在衣滴蟲(Chlamydomonas)和草履蟲(Paramecium)中發(fā)現(xiàn)了δ和η微管蛋白[4,5], 這2種微管蛋白的突變,都會導(dǎo)致基體(Basal body)功能的缺陷。ε微管蛋白首次在哺乳動物中報道[6], 免疫熒光定位顯示其定位于中心體區(qū)域。目前通常將真核生物微管蛋白家族分為α、β、γ、δ、ε和η六個亞家族[7,8]。

纖毛蟲是一類單細(xì)胞真核生物, 細(xì)胞表面普遍存在纖毛或纖毛器, 而且單個細(xì)胞中含有多種形態(tài)和功能迥異的微管結(jié)構(gòu), 例如嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)細(xì)胞中有多達(dá)17種微管結(jié)構(gòu)[9]。因此纖毛蟲是研究微管組裝及異質(zhì)性(Heterogeneity)的模式生物[10]。目前關(guān)于纖毛蟲微管蛋白的報道主要集中在四膜蟲和草履蟲中, 關(guān)于其他纖毛蟲的研究較少。近年來, 多種纖毛蟲的大核基因組測序已完成, 使得我們可以對處于不同進(jìn)化地位的纖毛蟲中微管蛋白基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析。

游仆蟲(Euplotes)是纖毛蟲中進(jìn)化最為復(fù)雜和高等的類群之一, 其細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 有背腹分化及橫微管束等復(fù)雜的微管胞器[11]。本研究利用八肋游仆蟲(Euplotes octocarinatus)大核基因組數(shù)據(jù)庫[12,13], 對其微管蛋白基因進(jìn)行了鑒定和亞家族分類, 并與其他纖毛蟲進(jìn)行了比較分析; 利用多序列比對及Western blot證實八肋游仆蟲η微管蛋白基因是+1位編程性核糖體移碼基因, 為后續(xù)深入研究游仆蟲微管蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

八肋游仆蟲由本課題組培養(yǎng); α微管蛋白抗體和山羊抗兔IgG(IRDye?800CW)二抗購自Abcam公司, BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司, 蛋白Marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 數(shù)據(jù)來源

八肋游仆蟲基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由本實驗室前期測得[12,13]。嗜熱四膜蟲、第四雙小核草履蟲(P. tetraurelia)、三棱尖毛蟲(Oxytricha trifallax)、浮萍棘尾蟲(Stylonychia lemnae)、多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)和天藍(lán)喇叭蟲(Stentor coeruleus)的相關(guān)數(shù)據(jù)分別下載自其基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(Ciliates.org, http://ciliates.org/index.php/home/welcome); 水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembus persalinus)的相關(guān)數(shù)據(jù)下載自PPGD(http://ciliates.ihb.ac.cn/database/home/#pp)、厚游仆蟲(E.crassus)及南極嗜冷游仆蟲(E. forcardii)的基因組數(shù)據(jù)下載自Gen-Bank數(shù)據(jù)庫[15], 大腸桿菌的絲狀溫度敏感蛋白(Filamentous thermosensitive protein Z, FtsZ)序列下載自GenBank數(shù)據(jù)庫(KIH34997.1)。用于構(gòu)建進(jìn)化樹的各物種的18S rRNA序列均下載自GenBank數(shù)據(jù)庫:E. octocarinatus(AJ310489.1)、E. crassus(AJ310 492.1)、E. focardii(EF094961.1)、I. multifiliis(KJ 690569.1)、P. persalinus(AY835669.1)、S. coeruleus(AM713189.1)、O. trifallax(FJ545743.1)、S. lemnae(AM086654.1)、T. thermophila(M10932.1)、P. tetraurelia(KY852452.1)和Homo sapiens(M10098.1)。

1.3 八肋游仆蟲微管蛋白基因的鑒定

草履蟲的微管蛋白基因家族最為完整, 因此本研究利用其微管蛋白氨基酸序列作為queries對八肋游仆蟲基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tblastn搜索(E-value≤0.01), 然后將鑒定得到的微管蛋白基因序列作為queries, 對NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-redundant protein sequences database)進(jìn)行Blastx搜索(Evalue≤10-5), 檢查每條序列Blastx結(jié)果的匹配項是否為微管蛋白, 根據(jù)Blastx結(jié)果中匹配項的注釋信息, 初步將其歸入6個微管蛋白亞家族中。接著對八肋游仆蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn搜索, 找到對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。

1.4 八肋游仆蟲微管蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

以大腸桿菌的FtsZ蛋白作為外類群, 利用軟件MEGA5.1[16]進(jìn)行多序列比對, 通過手工進(jìn)行了相應(yīng)的校正, 利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 并進(jìn)行1000次自展(Bootstrap)檢驗來評估進(jìn)化樹分支可信度。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用在線分析軟件EMBOSS中的GetOrf程序預(yù)測微管蛋白的氨基酸長度[17]; 利用ExPASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)在線預(yù)測其理論分子量; 利用Clustal X (v2.0)[18]的多序列比較程序(Do complete alignment)對八肋游仆蟲、第四雙小核草履蟲、厚游仆蟲及嗜冷游仆蟲的η微管蛋白進(jìn)行多序列比對分析(默認(rèn)參數(shù))。

1.6 抗體的制備及Western blot分析

八肋游仆蟲η微管蛋白多克隆抗體由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司定制。選取位于移碼位點(diǎn)下游的肽段(Glu257-Glu-Glu-Leu-Ser-Cys-Asp-Lys-Asn-Lys-Asp-Trp-Gln-Asp270)進(jìn)行多肽合成, 用合成的多肽免疫兔子制備抗體。提取八肋游仆蟲總蛋白, BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度, 按相等蛋白質(zhì)上樣量用10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離, 轉(zhuǎn)膜, 用封閉液封閉, 按照1﹕600的比例稀釋Eoη-tub多克隆抗體, 4℃過夜孵育; 加入對應(yīng)的二抗, 室溫溫育1h, 用PBST洗膜4次, 每次10min, 用Odyssey紅外激光成像儀掃膜成像分析。

2 結(jié)果

2.1 八肋游仆蟲微管蛋白基因的鑒定及分類

以第四雙小核草履蟲的微管蛋白作為查詢序列, 通過BLAST搜索, 最終從八肋游仆蟲基因組中鑒定得到20個微管蛋白基因(表 1), 基于同源比對結(jié)果及在生物進(jìn)化樹中的位置, 將所有的微管蛋白基因分為α、β、γ、δ、ε及η六個亞家族(圖 1)。

圖1 八肋游仆蟲微管蛋白基因家族序列分析Fig. 1 Sequence analysis of the tubulin gene families from Euplotes octocarinatus

八肋游仆蟲α微管蛋白(Eoα-tub)亞家族共包含6個基因, 其中Contig18065的氨基酸序列與已報道的Eoα-tub僅1個氨基酸不同[19], 其余5個基因與已報道的Eoα-tub氨基酸序列一致性較低(30.36%—42.18%), 但BLASTP比對結(jié)果中均為其他生物的α微管蛋白, 參考嗜熱四膜蟲微管蛋白基因的命名方法[20], 我們將這5個非經(jīng)典的α微管蛋白同源基因命名為α-tub-like。β微管蛋白亞家族包括10個基因,其中4個基因與已報道的Eoβ-tub的序列一致性均大于95%[19], 其余序列同源性較低的6個基因命名為βtub-like。γ、δ、ε及η四個亞家族各包含一個基因,沒有其他直系同源基因(表 1)。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 對所有微管蛋白基因的內(nèi)含子個數(shù)、氨基酸長度、理論分子量及RPKM值進(jìn)行了分析(表 1)。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中, 找到了除Eoα-tub-like-4和Eoα-tub-like-5外所有微管蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本。雖然α和β微管蛋白亞家族都有多個基因, 但同一亞家族不同成員的表達(dá)水平存在明顯差別(表 1)。在α亞家族中,Eoα-tub的RPKM值為2601.66, 遠(yuǎn)高于幾種Eoα-tub-like基因。在β亞家族中,Eoβ-tub1、Eoβ-tub3、Eoβ-tub4及Eoβ-tub-like-4的RPKM值明顯高于亞家族的其他成員, 這一結(jié)果表明同一亞家族的不同基因存在表達(dá)的特異性,暗示其具有不同的生物學(xué)功能。

表1 八肋游仆蟲微管蛋白基因的分子特征Tab. 1 Molecular characteristics of the tubulin genes in Euplotes octocarinatus

2.2 八肋游仆蟲微管蛋白基因微染色體結(jié)構(gòu)分析

將轉(zhuǎn)錄本序列與基因組DNA序列進(jìn)行比對, 對八肋游仆蟲微管蛋白基因微染色體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析(圖 2)。所有的微染色體都含有兩端的端粒結(jié)構(gòu), 由于Eoα-tub-like-4和Eoα-tub-like-5沒有轉(zhuǎn)錄本, 根據(jù)同源比對結(jié)果對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。α亞家族的所有成員都沒有內(nèi)含子, β亞家族中, 所有Eoβ-tub基因都沒有內(nèi)含子, 但4個Eoβ-tub-like基因含有一個或多個內(nèi)含子, 而且這些內(nèi)含子的位置和長度差異較大, 最長的內(nèi)含子1086 bp, 最短的僅25 bp, 其他亞家族成員均含有一個或兩個內(nèi)含子。值得注意的是,Eoη-tub基因含有一個讀框內(nèi)終止密碼子, 我們推測該基因在翻譯過程中會發(fā)生+1位編程性核糖體移碼(Programmed ribosomal frameshifting, PRF)。

圖2 八肋游仆蟲微管蛋白基因微染色體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 Schematic representation of the Eo-tubulin nanochromosomes structure

2.3 Eoη-tub基因是+1位編程性核糖體移碼基因

游仆蟲中存在高頻率的編程性核糖體移碼現(xiàn)象[12,14,15], 在分析Eoη-tub基因結(jié)構(gòu)時, 發(fā)現(xiàn)該基因中存在2個部分重疊的開放閱讀框(圖 3A), ORF1由63位的起始密碼子ATG1和748位的終止密碼子TAA1組成, 編碼一個219個氨基酸的序列; ORF2由722位的ATG2和1379位的TAA2組成, 編碼一個200個氨基酸的序列。只有在TAA1處發(fā)生一次+1位移碼(Putative ORF), 才能編碼由411個氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)。

為了證實這一假設(shè), 首先將Eoη-tub蛋白與草履蟲及另外2種游仆蟲的同源蛋白進(jìn)行了多序列比對(圖 3B), 結(jié)果顯示移碼位點(diǎn)的賴氨酸(K)和天冬酰胺(N)高度保守。此外, 利用制備的Eoη-tub多克隆抗體通過Western blots檢測了八肋游仆蟲細(xì)胞內(nèi)是否存在全長的Eoη-tub蛋白。如圖 3C所示, Western blot檢測到一條大小與推測的全長蛋白分子量(46.66 kD)非常接近的條帶。以上結(jié)果表明,Eoηtub基因確實為+1位編程性核糖體移碼基因, 其滑動序列為AAA-TAA-T。

圖3 八肋游仆蟲η微管蛋白基因的表達(dá)需要編程性核糖體移碼Fig. 3 Programmed ribosomal frameshifting is likely required for expression of gene encoding η-tubulin in Euplotes octocarinatus

2.4 不同纖毛蟲中微管蛋白基因的比較分析

為了對纖毛蟲微管蛋白進(jìn)行系統(tǒng)分析, 對另外7種大核基因組已測序的纖毛蟲的微管蛋白基因進(jìn)行了鑒定(圖 4)。人、嗜熱四膜蟲和第四雙小核草履蟲的數(shù)據(jù)來自前期報道[7,9,20]。我們保留了前期研究人員對草履蟲及四膜蟲微管蛋白基因亞家族的分類, 本研究分析的幾種纖毛蟲微管蛋白基因全部歸入α、β、γ、δ、ε及η六個亞家族中。

圖4 八肋游仆蟲與其他纖毛蟲中微管蛋白基因的比較Fig. 4 Comparison of tubulin genes in Euplotes octocarinatus and other ciliates

所有的纖毛蟲都含有六類微管蛋白基因, 但每個微管蛋白亞家族所含的基因個數(shù)不同。大多數(shù)纖毛蟲的α和β微管蛋白亞家族都含有兩個或兩個以上的基因, 而多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)僅有一個α微管蛋白基因, 水滴偽康纖蟲(Pseudocohnilembus persalinus)僅有一個β微管蛋白基因。幾乎所有纖毛蟲的γ微管蛋白基因個數(shù)都不超過2個, 僅天藍(lán)喇叭蟲(Stentor coeruleus)含有3個γ微管蛋白基因。大部分纖毛蟲僅含有1個δ、ε及η微管蛋白基因, 天藍(lán)喇叭蟲含有2個ε微管蛋白基因,水滴偽康纖蟲的δ和ε微管蛋白基因各有2個。此外,所有自由生纖毛蟲都含有α-tub-like和β-tub-like微管蛋白基因, 但寄生蟲多子小瓜蟲和兼性寄生的水滴偽康纖蟲僅有經(jīng)典的α和β微管蛋白基因, 沒有鑒定到tub-like微管蛋白基因。

本研究分析的3種游仆蟲基因組中, 淡水種八肋游仆蟲只有1個經(jīng)典的α微管蛋白基因, 而海水種厚游仆蟲和嗜冷游仆蟲含有2—3個經(jīng)典的α微管蛋白基因; 八肋游仆蟲有5個α-tub-like微管蛋白基因,而厚游仆蟲和嗜冷游仆蟲只有2個α-tub-like微管蛋白基因。八肋游仆蟲的β微管蛋白基因亞家族成員較多, 包括4個經(jīng)典的β微管蛋白基因6個β-tublike微管蛋白基因, 厚游仆蟲只有1個經(jīng)典的β微管蛋白基因和2個β-tub-like微管蛋白基因; 嗜冷游仆蟲有4個經(jīng)典的β微管蛋白基因和1個β-tub-like微管蛋白基因。

對纖毛蟲α及β微管蛋白亞家族成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖 5), 結(jié)果表明所有纖毛蟲中經(jīng)典的α/β微管蛋白明顯單獨(dú)聚為一枝, 而α-tub-like和βtub-like微管蛋白聚為多個不同的進(jìn)化枝, 暗示纖毛蟲的α-tub-like和β-tub-like微管蛋白具有多個獨(dú)立的起源。此外, 某些纖毛蟲的微管蛋白基因在進(jìn)化過程發(fā)生了基因復(fù)制事件, 例如嗜熱四膜蟲Ttβtub-like4和Ttβ-tub-like5基因及厚游仆蟲的2個經(jīng)典α微管蛋白基因Ecα-tub1和Ecα-tub2, 在進(jìn)化樹上位于直接相鄰的2個分枝, 表明它們來源于種內(nèi)的基因復(fù)制事件。以上結(jié)果表明, 纖毛蟲微管蛋白基因在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了復(fù)雜的基因復(fù)制和丟失過程。

圖5 纖毛蟲α及β微管蛋白亞家族系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of α and β tubulin subfamilies in ciliates

3 討論

作為細(xì)胞骨架的主要成分, 微管蛋白廣泛存在于各種真核生物中, 因此微管蛋白基因序列常被用于物種的系統(tǒng)發(fā)生研究[21,22]。近年來大量生物的基因組被測定, 使研究人員能夠從整體水平對微管蛋白基因的多樣性進(jìn)行探討[7,8]。不同真核生物含有的微管蛋白亞家族種類不同, α、β和γ微管蛋白亞家族保守存在于所有真核生物中, 而δ、ε和η微管蛋白只存在于某些真核生物中[7,23]。纖毛蟲擁有最為豐富的微管結(jié)構(gòu)[24], 本研究對八肋游仆蟲的微管蛋白基因進(jìn)行了鑒定和亞家族分類, 結(jié)果表明其含有6個微管蛋白亞家族(表 1)。Erin等[23]發(fā)現(xiàn)缺少ε微管蛋白的生物一般也缺少δ和η微管蛋白, 而含有ε微管蛋白的生物通常也至少含有δ和η微管蛋白中的一種, 這3種微管蛋白形成了一個保守的進(jìn)化模塊。缺少這3種微管蛋白的生物通常沒有中心粒結(jié)構(gòu)或者缺少中心粒附屬物。例如, 酵母(Yeast)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)沒有正常的中心粒, 因此它們都不含有δ、ε及η微管蛋白[8,23]。纖毛蟲雖然沒有典型的中心粒和中心體, 但存在功能類似的基體[25], 本研究分析的所有纖毛蟲中都含有這3種微管蛋白基因(圖 4)。在纖毛蟲中, 這3種微管蛋白的破壞會導(dǎo)致顯著的細(xì)胞骨架缺陷, 說明它們在基體與細(xì)胞骨架的相互作用中具有重要作用, 例如四膜蟲ε微管蛋白的破壞會導(dǎo)致基體的定位和間距發(fā)生紊亂[26], 草履蟲η微管蛋白的突變會導(dǎo)致基體復(fù)制過程受損[5]。

在大部分真核生物中, α和β微管蛋白都是由多基因家族編碼的, 每個基因編碼1個獨(dú)特的蛋白亞型[27]。Liang等[19,28]從八肋游仆蟲中克隆到1個α微管蛋白和2個β微管蛋白基因。本研究從其大核基因組中共鑒定到6個α微管蛋白和10個β微管蛋白基因, 除經(jīng)典的α和β微管蛋白基因外, 還鑒定到5個非經(jīng)典的α-tub-like和6個β-tub-like微管蛋白基因?！癿ulti-tubulin”假說認(rèn)為, 細(xì)胞內(nèi)每1種微管蛋白亞型發(fā)揮特定的功能, 組成不同的微管結(jié)構(gòu)[3]。例如,人類的某些先天性神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由不同的微管蛋白亞型突變引起的[29]。在果蠅中, 精子尾部基因絲的裝配需要特定的微管蛋白亞型形成中心微管對[30]。本研究發(fā)現(xiàn)α-tub-like和β-tub-like微管蛋白基因廣泛存在于所有自由生纖毛蟲基因組中, 而寄生的多子小瓜蟲和兼性寄生的水滴偽康纖蟲只含有經(jīng)典的α和β微管蛋白(圖 4)。Sandra等[31]對嗜熱四膜蟲中不同β微管蛋白亞型的細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)及生物功能進(jìn)行了比較分析, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的β微管蛋白BTU2存在于體纖毛及基體, 而非經(jīng)典的β-like微管蛋白BLT1和BLT4參與形成大核的微管結(jié)構(gòu)及小核的有絲分裂器(Mitotic apparatus), 此外, BLT1還參與形成配對時期小核中減數(shù)分裂器(Meiotic apparatus)的微管結(jié)構(gòu)。我們推測在其他自由生纖毛蟲中, 這些tub-like微管蛋白亞型可能也具有類似的功能, 用于構(gòu)建功能不同的微管結(jié)構(gòu)。此外, 八肋游仆蟲不同微管蛋白亞型之間RPKM值差異較大(表 1),暗示細(xì)胞內(nèi)不同亞型的表達(dá)受到發(fā)育階段的嚴(yán)格調(diào)控。有研究表明不同的微管蛋白在細(xì)胞中可通過翻譯后修飾產(chǎn)生具有不同功能的微管結(jié)構(gòu)[27], 多子小瓜蟲及水滴偽康纖蟲不含有α-tub-like和β-tublike微管蛋白基因, 它們可能是利用多種翻譯后修飾來形成不同的微管結(jié)構(gòu)。

本研究證實Eoη-tub基因是一個+1位編程性核糖體移碼基因(圖 3)。游仆蟲中存在高頻率的編程性核糖體移碼現(xiàn)象, 且移碼類型多樣[12,15]。游仆蟲中的移碼基因中大部分是酶, 尤其是蛋白激酶[12],本研究發(fā)現(xiàn)參與基體組裝的η微管蛋白也是編程性核糖體移碼基因, 進(jìn)一步說明在游仆蟲中編程性核糖體移碼被廣泛應(yīng)用于各種基因的表達(dá)調(diào)控, 并不局限于某一類基因。此外, 前期研究發(fā)現(xiàn)八肋游仆蟲編程性核糖體移碼基因的表達(dá)豐度明顯低于正?；騕14], 在本研究鑒定出的20種微管蛋白中,Eoη-tub基因的表達(dá)量較低(RPKM值5.89), 而其他表達(dá)量較高的微管蛋白基因在翻譯過程中均不需要編程性核糖體移碼。這一結(jié)果暗示, 雖然游仆蟲可利用精密的移碼監(jiān)控機(jī)制來保證細(xì)胞內(nèi)移碼的精確進(jìn)行, 但它仍然會影響核糖體的翻譯速度, 所以在進(jìn)化過程中, 僅表達(dá)豐度較低的基因中保留了移碼位點(diǎn)。在真核生物鳥氨酸脫羧酶抗酶及細(xì)菌肽鏈釋放因子等被深入研究的PRF基因中, 其移碼序列及移碼類型都是非常保守的[32,33]。在分析E.focardii及E. crassus的η微管蛋白基因過程中發(fā)現(xiàn),Ef η-tub基因不發(fā)生PRF, 而Ec η-tub基因需要發(fā)生一次+1 PRF和一次+2 PRF, 但移碼位點(diǎn)與八肋游仆蟲Eo η-tub基因的移碼位點(diǎn)并不相同, 表明游仆蟲中的PRF在進(jìn)化中并不保守。