何先喆，唐慶九，潘江安，俞 苓，劉潔純

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403；3.無錫藥明生物技術(shù)股份有限公司，江蘇 無錫 214100）

我國(guó)作為食用菌生產(chǎn)大國(guó)，食用菌種類繁多，2019年產(chǎn)量已達(dá)3 900萬(wàn)噸[1]，意味著每年也會(huì)產(chǎn)生大量的菌糠廢棄物。其中蛹蟲草（Cordyceps militaris）作為一種大型食（藥）用真菌，在食品、保健品行業(yè)的市場(chǎng)需求也逐漸增大。蛹蟲草富含核苷類、蟲草多糖、甾醇類、蛋白質(zhì)、黃酮和氨基酸類等活性成分[2]，具有抑菌[3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]和降血糖血脂[6]等多種藥理活性。其中，蛹蟲草中的蟲草素[7]、β-胡蘿卜素[8]、多肽類[9]等成分對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌均表現(xiàn)出一定抑制效果。蛹蟲草菌糠由菌絲體、培養(yǎng)基基質(zhì)和發(fā)酵代謝產(chǎn)物組成[10]，價(jià)格低廉且數(shù)量巨大，具有較高研究利用價(jià)值。但目前部分菌糠僅添加應(yīng)用于飼料、化肥中[11]，大多直接作為廢棄物處理，造成了環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。為拓展蛹蟲草菌糠開發(fā)再利用領(lǐng)域，對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了探究。

檢測(cè)抑菌活性時(shí)常用的測(cè)定方法有擴(kuò)散法[12]、比濁法[13]和微量肉湯稀釋法[14]?，F(xiàn)有食用菌抑菌活性研究中較常采用擴(kuò)散法，但擴(kuò)散法對(duì)食用菌提取物不夠靈敏。當(dāng)樣品濃度較低時(shí)無法清晰得到抑菌圈，容易導(dǎo)致判斷失誤[15]。同時(shí)由于測(cè)定方法的不同，不同來源的食用菌抗菌活性也無法進(jìn)行比較。微量肉湯稀釋法操作簡(jiǎn)便，可以實(shí)現(xiàn)不同樣品抑菌活性的高通量篩選[16]。但在篩選食用菌的抑菌活性時(shí)會(huì)受到食用菌提取液顏色影響，且食用菌中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，會(huì)促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。因此通過優(yōu)化一種適用于食用菌的快速高效抑菌活性篩選方法，并對(duì)蛹蟲草菌糠的抑菌效果及活性成分進(jìn)行探析，為蛹蟲草菌糠的開發(fā)再利用提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分析純乙醇、色譜純甲醇，國(guó)藥（上海） 化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、蟲草素，美國(guó)Sigma公司；M-H肉湯培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；雙抗（青霉素10 000 U·mL-1，鏈霉素10 000 μg·mL-1），賽默飛世爾科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；蛹蟲草菌糠、蛹蟲草G18a-1子實(shí)體、靈芝（Ganoderma lucidum） S2、竹蓀 （Dictyophora indusiata）、蟬 花（Isaria cicadae Miquel）、白僵菌（Beauveria spp.）由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

SX-500立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，日本tomy公司；ZWY-240恒溫?fù)u床，上海智城公司；隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Biotek-Synergy HT多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；Alpha 2-4 LDplus凍干機(jī)，德國(guó)Christ公司；Waters 600型高效液相色譜儀（配Waters 2996紫外檢測(cè)器），美國(guó)Waters公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌方法的優(yōu)化

參照CLSI（美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)） 推薦的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法[17]，優(yōu)化抑菌方法。將大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用M-H肉湯（mueller-hinton-broth） 對(duì)菌液進(jìn)行對(duì)倍稀釋，使菌液吸光度在600 nm下符合0.5麥?zhǔn)蠞岫龋创竽c桿菌數(shù)量約1×108cfu·mL-1），再稀釋100倍備用。放入36℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值計(jì)算其抑制率。試驗(yàn)采用抗菌藥物雙抗（青霉素-鏈霉素）作為陽(yáng)性對(duì)照，每組3個(gè)平行。

抑制率（K，%） 計(jì)算公式為：

K=[1-(OD1-OD0)/(OD-OD’)]×100%

式中：OD1為加樣組培養(yǎng)后的吸光度；OD0為加樣組培養(yǎng)前的吸光度；OD為細(xì)菌陰性對(duì)照組培養(yǎng)后的吸光度；OD’為細(xì)菌陰性對(duì)照組培養(yǎng)前的吸光度。

1）培養(yǎng)基濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

分別配制1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍濃度的M-H肉湯培養(yǎng)基，檢測(cè)菌落生長(zhǎng)狀況，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2）菌液濃度對(duì)抑菌活性的影響

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷岫龋淳簼舛葹?×108cfu·mL-1），再分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍、800倍和1 600倍，即孔板內(nèi)菌液的濃度分別為2.00×106cfu·mL-1、1.00×106cfu·mL-1、5.00 ×105cfu·mL-1、2.50×105cfu·mL-1、1.25×105cfu·mL-1、6.25×104cfu·mL-1。取200 μL稀釋菌液和10 μL雙抗加入 96孔板，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

3）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

選定合適的菌液濃度，分別再培養(yǎng)12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h，測(cè)定雙抗對(duì)大腸桿菌的抑制率，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 食用菌抑菌效果篩選

采用優(yōu)化后抑菌方法對(duì)5種食用菌進(jìn)行抑制大腸桿菌活性比較。稱取1 g樣品加入5 mL蒸餾水100℃加熱提取2 h，取2 mL提取液12 000 r·min-1離心10 min，取上清液稀釋后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。其中，96孔板每孔加樣量為100 μL樣品和100 μL稀釋菌液，使最終樣品濃度為25 mg·mL-1，陽(yáng)性對(duì)照以100 μL 濃度為 25 μg·mL-1的雙抗替代樣品，設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 抑菌活性物質(zhì)的初步分離

取200 g蛹蟲草菌糠，加2 L水100℃提取1 h，提取2次。將2次提取液合并后，4 000 r·min-1離心10 min，并取部分提取液凍干，得到總水提物組分，剩余部分分于大孔樹脂分離純化取50 g的NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂放入提取液中，并用頂置式攪拌器攪拌過夜，再取上清凍干得吸附后上清組分；過濾收集樹脂并用清水洗凈后依次用40%乙醇500 mL洗脫得40%洗脫組分，再用90%乙醇500 mL洗脫得90%洗脫組分。重復(fù)上述提取吸附操作后，直接采用95%乙醇洗脫得95%洗脫組分。將40%洗脫組分、90%洗脫組分和95%洗脫組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，凍干。將凍干后各組分用蒸餾水溶解，恒溫振蕩儀100℃加熱滅菌15 min，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，其中96孔板每孔加樣量為100 μL樣品和100 μL菌懸液，使最終樣品濃度為 25 mg·mL-1、12.5 mg·mL-1。

1.2.4 抑菌活性物質(zhì)的檢測(cè)

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蛹蟲草菌糠提取液中蟲草素含量[18]。色譜條件：色譜柱為Venusil MP C18柱 （250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水 （20 ∶80）；流速 1 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量10 μL；室溫測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

設(shè)立3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2010和GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌方法的優(yōu)化

目前也有較多學(xué)者對(duì)食用菌的抑菌活性進(jìn)行了探究，其中大多采用擴(kuò)散法。陳炳智[19]采用平板打孔法和原位抑菌法測(cè)定了長(zhǎng)裙竹蓀（Dictyophora indusiata）對(duì)巨大芽孢桿菌和腸炎沙門氏菌的抑制效果。韓燕峰等[20]采用打孔擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn)蛹蟲草發(fā)酵液及菌絲提取物對(duì)大腸桿菌均具有一定抑制作用。但食用菌提取物成分復(fù)雜多樣，采用傳統(tǒng)方法測(cè)定對(duì)抑菌結(jié)果判定不太精確，且無法對(duì)多種食用菌進(jìn)行同時(shí)篩選比較。因此需優(yōu)化一種簡(jiǎn)便、靈敏且適用于大部分食用菌的抑菌快速篩選方法。

食用菌提取液一般顏色較深，且在培養(yǎng)過程中顏色基本不會(huì)發(fā)生改變，因此測(cè)定培養(yǎng)前后的吸光度，并將培養(yǎng)前的吸光度作為本底值減去可以基本消除食用菌提取液顏色的影響。食用菌提取液中成分復(fù)雜，包括多種類型的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，會(huì)造成樣品組細(xì)菌增殖遠(yuǎn)超過陰性對(duì)照組，使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。為降低食用菌提取液營(yíng)養(yǎng)成分的影響，采用提高培養(yǎng)基濃度的方法，在測(cè)定過程中保持過量的營(yíng)養(yǎng)，抵消食用菌提取液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)于抑菌活性測(cè)定的影響。不同濃度的M-H肉湯培養(yǎng)基吸光度的測(cè)定結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基濃度的增加，吸光度先增加后降低，說明當(dāng)濃度過低時(shí)大腸桿菌未充分得到增殖所需的物質(zhì)，當(dāng)濃度過高時(shí)使?jié)B透壓升高，造成大腸桿菌無法獲得營(yíng)養(yǎng)。因此2.5倍M-H肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌菌液活性最好，后續(xù)試驗(yàn)采用該濃度進(jìn)行篩選。

考察不同濃度雙抗在改變菌液濃度、培養(yǎng)時(shí)間后對(duì)大腸桿菌抑制效果的影響見圖2、圖3。

圖2 菌液濃度對(duì)抑菌效果的影響Fig.2 Influence of bacteria liquid concentration on antibacterial effect

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Influence of culture time on antibacterial effect

如圖2、圖3所示，對(duì)比可知，雙抗?jié)舛冗^高時(shí)可起到完全抑菌效果，濃度過低時(shí)抑菌效果較差，無法判斷其他因素的影響。因此通過觀察25 μg·mL-1雙抗的抑制率變化趨勢(shì)來確定其他最優(yōu)條件。大腸桿菌菌液濃度在 2.5×105cfu·mL-1～1.0×106cfu·mL-1范圍內(nèi)，抑制率相對(duì)穩(wěn)定，隨著菌液濃度的增大，抑制率下降趨勢(shì)也隨之增大，因此后期試驗(yàn)選擇適宜菌液濃度為5.0×105cfu·mL-1。大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)間在12 h～18 h范圍內(nèi)，雙抗的抑菌效果較好，培養(yǎng)超過18 h后，抑制率逐漸降低，因此選擇培養(yǎng)時(shí)間16 h作為抑菌效果觀察階段。

2.2 食用菌抑菌效果的篩選

前期試驗(yàn)對(duì)幾種食用菌水提物和醇提物抑菌活性比較發(fā)現(xiàn)食用菌水提物的抑菌效果較好，因此對(duì)5種食用菌的水提物抑菌活性進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 不同食用菌抑菌結(jié)果比較Fig.4 Antibacterial results of different edible fungi

由圖4比較得知，5種食用菌對(duì)大腸桿菌均具有抑制效果，其中蛹蟲草的抑菌活性最好，對(duì)大腸桿菌的抑制率為58.01%。蛹蟲草的抑菌活性已被廣泛驗(yàn)證，但目前對(duì)蛹蟲草菌糠的活性研究較少，未見對(duì)其抑菌活性的探究。因此再次對(duì)蛹蟲草菌糠進(jìn)行抑菌效果檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌糠提取液對(duì)大腸桿菌也有一定的抑制效果?，F(xiàn)在僅有部分研究為充分利用蛹蟲草菌糠中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其添加應(yīng)用到保健醋[21]、保健酒[22]中，對(duì)蛹蟲草菌糠的抑菌活性進(jìn)行研究可以為其開發(fā)再利用拓展新領(lǐng)域，因此后續(xù)采用蛹蟲草菌糠為原料，對(duì)其中成分進(jìn)行分離，以探究其中抑菌活性部位及成分。

2.3 抑菌活性物質(zhì)跟蹤分離

蛹蟲草菌糖分離后各組分抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 蛹蟲草菌糠各組分對(duì)大腸桿菌的抑制結(jié)果Fig.5 Inhibitory effects of various components of Cordyceps militaris chaff on Escherichia coli

由圖5比較可知，蛹蟲草菌糠提取物各組分對(duì)大腸桿菌均有一定抑制效果，且經(jīng)分離純化后，抑菌效果得到大幅提升。通過組分1和組分2抑制率對(duì)比發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂吸附后，上清對(duì)大腸桿菌的抑制率降低，說明抑菌活性物質(zhì)濃度下降，有效抑菌成分被NKA-II大孔樹脂吸附富集；組分3和組分4分別為用40%乙醇和90%乙醇逐級(jí)洗脫物質(zhì)，2組分抑菌活性較好，抑制率分別為59.7%、86.7%，均超過總水提物。后繼續(xù)采用95%乙醇直接對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)該組分抑菌效果最好，濃度25 mg·mL-1時(shí)抑菌效果幾乎與陽(yáng)性對(duì)照持平，抑菌率為94.01%，說明蛹蟲草菌糠中抑菌成分在此組分中含量最高。

2.4 抑菌活性成分的檢測(cè)

核苷類成分為蛹蟲草中主要抑菌成分之一[23]，蛹蟲草菌糠主要由菌絲體、代謝產(chǎn)物等組成，也具有子實(shí)體中相似成分。各組分HPLC檢測(cè)圖譜見圖6?，F(xiàn)有研究對(duì)蛹蟲草菌糠中核苷類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中蟲草素含量較高[24]，故采用HPLC對(duì)蛹蟲草菌糠各分離組分進(jìn)行蟲草素含量的測(cè)定。由峰保留時(shí)間、峰面積與蟲草素標(biāo)品對(duì)比計(jì)算蟲草素含量見表1。

圖6 蛹蟲草菌糠各組分蟲草素HPLC圖譜Fig.6 HPLC profile of cordycepin from the Cordyceps militaris chaff

表1 蛹蟲草菌糠各組分蟲草素含量Tab.1 Cordycepin content of Cordyceps militaris substrate chaff

結(jié)合抑菌結(jié)果及蟲草素含量可知各組分抑菌效果與蟲草素含量呈正相關(guān)，抑菌效果較好組分蟲草素含量也較高。上述試驗(yàn)得到的抑菌效果最好為95%洗脫組分，蟲草素含量也最高，可達(dá)89.9%。Jiang等[25]也發(fā)現(xiàn)蟲草素具有廣譜抑菌性，可以有效抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌。因此確定蟲草素是蛹蟲草菌糠中主要抑菌活性成分之一。

3 結(jié)論

食用菌因其成分復(fù)雜，在采用常規(guī)抑菌方法時(shí)有檢測(cè)結(jié)果不精確等問題，對(duì)其抑菌方法進(jìn)行優(yōu)化，消除了食用菌提取物顏色深、營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜等問題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種食用菌抑菌效果準(zhǔn)確、高效的高通量檢測(cè)。通過對(duì)比蛹蟲草G18a-1、靈芝S2、竹蓀、蟬花、白僵菌5種食用菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)蛹蟲草對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好，抑制率達(dá)到58.01%。進(jìn)一步對(duì)該蛹蟲草菌糠進(jìn)行抑菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其也具有一定抑制效果。因此，對(duì)蛹蟲草菌糠進(jìn)行抑菌成分吸附分離并定性分析；抑菌結(jié)果顯示，95%洗脫組分＞90%洗脫組分＞40%洗脫組分＞總水提物＞吸附后上清。HPLC蟲草素含量測(cè)定結(jié)果顯示，各組分的抑菌效果與蟲草素含量呈正比。其中95%洗脫組分抑菌率最高為94.01%，測(cè)得蟲草素含量最高為89.9%，可知蟲草素為蛹蟲草菌糠中主要抑菌成分之一。蛹蟲草菌糠相較于子實(shí)體而言，產(chǎn)量巨大且價(jià)格便宜，因此該研究為采用蛹蟲草菌糠制備天然、綠色、安全的防腐劑提供可能性，蛹蟲草菌糠后續(xù)開發(fā)再利用具有廣闊市場(chǎng)前景。