宋小亞，劉德云，路新彥，劉 昆，蔣 俊

（浙江省麗水市農(nóng)林科學(xué)研究院，浙江 麗水 323000）

猴頭菌 [Hericium erinaceus(Bull.)Pers.]，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales） 猴頭菌科（Hericiaceae） 猴頭菌屬（Hericium），是一種高蛋白、高纖維、低脂肪的天然健康食品，菌絲體和子實(shí)體中富含多糖、多酚、甾醇、腺苷、猴頭菌素、猴頭菌酮、不飽和脂肪酸等活性成分，具有獨(dú)特的食（藥）用價(jià)值，已成為開發(fā)功能性食品、保健品和藥品的重要資源[1-2]。

種質(zhì)資源是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)。與香菇（Lentinus edodes)、平菇 (Pleurotus ostreatus） 等大宗食用菌種類相比，猴頭菌種質(zhì)資源儲備較少，栽培品種多由野生種質(zhì)馴化選育而來，早期育種的目標(biāo)性狀多為菇形好、產(chǎn)量高等[3-4]。近年來，隨著猴頭菌深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，高含量活性成分的原料需求不斷提升，新的生產(chǎn)栽培模式也在探索中發(fā)展，育種目標(biāo)已漸趨多元化[5-6]，對具有更多優(yōu)異性狀種質(zhì)資源的需求也更加迫切。野生種質(zhì)是開展育種工作的優(yōu)良資源寶庫，對其農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀和基因型等進(jìn)行精準(zhǔn)化鑒定評價(jià)，能夠發(fā)掘滿足現(xiàn)代育種需求和具有重要應(yīng)用前景的優(yōu)異種質(zhì)和關(guān)鍵基因[7-8]。目前猴頭菌種質(zhì)多以農(nóng)藝性狀結(jié)合多糖或麥角甾醇進(jìn)行評價(jià)[9-10]，但能結(jié)合多個(gè)栽培品種和遺傳差異分析對野生種質(zhì)進(jìn)行多性狀綜合評價(jià)的研究甚少。

本研究團(tuán)隊(duì)在猴頭菌種質(zhì)資源收集過程中，發(fā)現(xiàn)一株子實(shí)體表型別具特色的野生種質(zhì)，對其栽培性狀、遺傳特異性和品質(zhì)性狀等進(jìn)行了多重比較評價(jià)，以期闡明種質(zhì)特性并為進(jìn)一步深入研究利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株麗猴1號來源于野生種質(zhì)，由劉德云等于2012年在云南香格里拉倒木上采集到子實(shí)體，經(jīng)組織分離后得到純菌種，編號C，經(jīng)多年馴化栽培后定名，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11409。

菌株猴雜19由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供（國認(rèn)品種），菌株猴頭911由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供（國認(rèn)品種），菌株猴頭99由浙江省常山縣天樂食用菌研究所提供（浙江省主栽品種）。

1.2 培養(yǎng)基、培養(yǎng)料配方

加富PDA培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、瓊脂粉20 g、KH2PO40.46 g、K2HPO41.0 g、MgSO20.5 g、雜木屑煮出液 20 g，蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL。

原種培養(yǎng)料配方：雜木屑78%、麩皮20%、糖1%、石膏1%，pH自然，含水量50%～55%。

栽培培養(yǎng)料配方：棉籽殼35%、木屑47%、麩皮17%、輕質(zhì)碳酸鈣1%，pH自然，含水量55%～60%。

1.3 栽培試驗(yàn)

采用南方地區(qū)常用的長棒層架立體栽培模式，9月下旬至10月上旬接種發(fā)菌（栽培袋規(guī)格：17 cm×55 cm），自然室溫下發(fā)菌；11月上旬排場進(jìn)入出菇期管理，菇棚內(nèi)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)區(qū)組，每個(gè)區(qū)組放置30棒。

1.4 農(nóng)藝性狀

觀測菌絲生長速度、子實(shí)體形態(tài)等農(nóng)藝性狀。每個(gè)菌株隨機(jī)選取6棒，間隔5 d劃線測量生長距離，計(jì)算菌絲平均生長速度；子實(shí)體性狀考察參考NY/T 3717-2020植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南猴頭菌[11]。最后統(tǒng)計(jì)各區(qū)組的出菇產(chǎn)量數(shù)據(jù)，計(jì)算每棒平均產(chǎn)量。

1.5 品質(zhì)性狀

研究表明，猴頭菌的小菌刺期子實(shí)體適合食用，中菌刺期子實(shí)體適合藥用[12]。委托浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院對小菌刺期子實(shí)體干品的蛋白質(zhì)、脂肪含量進(jìn)行測定，檢測依據(jù)分別為GB 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測定和GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測定[13-14]。測定中菌刺期子實(shí)體干品的活性成分粗多糖、麥角甾醇含量：粗多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[15]；麥角甾醇含量測定采用高效液相法，參照來李娟等的方法[16-17]。

1.6 遺傳差異分析

委托農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（武漢）依據(jù)NY/T 1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應(yīng)和NY/T 1730-2009食用菌菌種真實(shí)性鑒定ISSR法對麗猴1號、猴雜19、猴頭911和猴頭99菌株進(jìn)行遺傳差異分析[18-19]。對擴(kuò)增產(chǎn)物分析后，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)出現(xiàn)的穩(wěn)定性條帶，有條帶的記為1，無條帶記為0，用NTSYS-pc 2.0軟件進(jìn)行聚類分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所測數(shù)據(jù)利用SPSS v19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀

2.1.1 菌絲生長速度

測定分析結(jié)果表明，菌株麗猴1號、猴雜19、猴頭99和猴頭911的菌絲平均生長速度分別為（0.44 ± 0.04） cm·d-1、（0.48 ± 0.03） cm·d-1、（0.48 ±0.02） cm·d-1和 （0.43±0.04） cm·d-1，菌株麗猴 1 號與3個(gè)栽培菌株的菌絲生長速度相比無顯著性差異。

2.1.2 子實(shí)體性狀

栽培菌株猴雜19和野生菌株麗猴1號的成熟子實(shí)體形態(tài)見圖1。

圖1 栽培菌株猴雜19和野生菌株麗猴1號的成熟子實(shí)體Fig.1 Mature fruiting bodies of strain Houza 19 and wild strain Lihou 1

對子實(shí)體性狀觀測發(fā)現(xiàn)，栽培菌株猴雜19、猴頭99和猴頭911的子實(shí)體性狀較為接近，子實(shí)體單生，白色，菇形圓整、頭狀或團(tuán)塊狀，菇體直徑10 cm～20 cm，質(zhì)地致密，菌刺相對粗、長、分支少；菌株麗猴1號與3個(gè)栽培菌株的性狀差異較大，主要表現(xiàn)在菇形、顏色、菇質(zhì)和菌刺方面。菌株麗猴1號子實(shí)體呈菜花狀，菇體直徑8 cm～20 cm，質(zhì)地較疏松，菌刺短、細(xì)密且多分支，尤其菇體顏色對光線極敏感，弱光下為白色，光線增強(qiáng)極易轉(zhuǎn)紅，新鮮子實(shí)體常呈淺粉紅色。該性狀區(qū)別于生產(chǎn)栽培品種和常見野生種質(zhì)，此前尚未見報(bào)道。多年的穩(wěn)定性栽培試驗(yàn)表明，菌株麗猴1號的子實(shí)體性狀較穩(wěn)定。

2.1.3 產(chǎn)量

產(chǎn)量分析結(jié)果表明，菌株麗猴1號、猴雜19、猴頭99和猴頭 911的平均產(chǎn)量分別為 （0.35±0.06）kg/棒、（0.49 ± 0.05） kg/棒、（0.48 ± 0.07） kg/棒和（0.49±0.05） kg/棒，菌株麗猴 1 號的產(chǎn)量顯著低于3個(gè)栽培菌株。菌株麗猴1號鮮菇產(chǎn)量偏低也與子實(shí)體形態(tài)特征有關(guān)，菜花狀、菌刺多分支、質(zhì)地較疏松的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其持水性相對較弱，鮮菇含水量低于3個(gè)栽培菌株。

2.2 品質(zhì)性狀

2.2.1 蛋白質(zhì)和脂肪含量

4個(gè)猴頭菌菌株小菌刺期子實(shí)體蛋白質(zhì)和脂肪含量測定結(jié)果見表1。

表1 4個(gè)猴頭菌菌株小菌刺期子實(shí)體的蛋白質(zhì)和脂肪含量（干品）Tab.1 The protein and fat content of dried fruiting bodies of four Hericium erinaceus strains at the stage of small spine formation

從表1可以看出，4個(gè)猴頭菌菌株子實(shí)體均表現(xiàn)出高蛋白、低脂肪的健康食品特性，其中菌株麗猴1號的蛋白質(zhì)和脂肪含量顯著高于3個(gè)栽培品種。菌株猴雜19、猴頭911和猴頭99的蛋白質(zhì)含量在18.0%～19.6%，而菌株麗猴 1 號的含量為 24.2%，比3 個(gè)栽培菌株分別高出 23.6%、34.4%和 33.0%；在脂肪含量方面，菌株麗猴1號為3.8%，比菌株猴雜19、猴頭911和猴頭99分別高出90.0%、34.4%和33.0%，差異明顯。相比較而言，菌株麗猴1號的蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，營養(yǎng)價(jià)值和食用口感更佳。

2.2.2 粗多糖和麥角甾醇含量

粗多糖和麥角甾醇是猴頭菌較有代表性的次生代謝產(chǎn)物，具有重要的生理活性。其測定的具體結(jié)果見表2。

表2 4個(gè)猴頭菌菌株中菌刺期子實(shí)體的粗多糖和麥角甾醇含量（干品）Tab.2 The crude polysaccharide and ergosterol content of dried fruiting bodies of four Hericium erinaceus strains at the stage of spine extension

從表2可以看出，與3個(gè)栽培菌株相比，菌株麗猴1號的粗多糖含量最高，顯著高于菌株猴頭99，而麥角甾醇含量和菌株猴頭911含量接近，顯著高于菌株猴雜19，但低于菌株猴頭99。4個(gè)猴頭菌菌株甲醇提取物的液相色譜圖見圖2。

圖2 4個(gè)猴頭菌菌株甲醇提取物的液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of methanol extracts of four Hericium erinaceus strains

從圖2也可以看出，4個(gè)猴頭菌菌株甲醇提取物的液相圖譜在出峰數(shù)量、峰面積及出峰位置上均呈現(xiàn)一定差異，與3個(gè)栽培菌株比較，菌株麗猴1號的出峰數(shù)量相對較多，表明其化學(xué)成分間存在較大的差異，在一定程度上可反映出菌株的差異性。

2.3 遺傳差異分析

2.3.1 拮抗試驗(yàn)

拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株麗猴1號與菌株猴雜19、猴頭99、猴頭911的菌落交界處菌絲隆起且有色素形成，表明菌株麗猴1號與3個(gè)栽培菌株均有拮抗，遺傳差異較大。

2.3.2 基于ISSR標(biāo)記的聚類分析

基于ISSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果見圖3。

圖3 基于ISSR標(biāo)記的猴頭菌菌株聚類分析Fig.3 Phylogenetic dendrogram of Hericium erinaceus strains based on ISSR markers

圖3分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)為 0.48水平上，4個(gè)猴頭菌菌株分為2個(gè)類群，菌株麗猴1號單獨(dú)歸為一個(gè)類群，而栽培菌株猴雜19、猴頭99、猴頭911聚為一類；在相似系數(shù)為 0.62水平上，菌株猴雜19與另外2個(gè)栽培品種分開。聚類結(jié)果表明3個(gè)栽培菌株的親緣關(guān)系相對較近，而與菌株麗猴1號的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大。拮抗試驗(yàn)和ISSR標(biāo)記分析結(jié)果均表明，菌株麗猴1號與3個(gè)栽培菌株間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異較大。

3 結(jié)論和討論

針對人們對未來優(yōu)質(zhì)健康食品的需求，發(fā)掘目標(biāo)性狀表現(xiàn)優(yōu)異、富含保健功能成分的特色種質(zhì)資源，創(chuàng)制有育種和開發(fā)價(jià)值的特色種質(zhì)，并對創(chuàng)新目標(biāo)性狀與綜合性狀協(xié)調(diào)表達(dá)及其育種效應(yīng)進(jìn)行研究，可為新興產(chǎn)業(yè)的形成奠定基礎(chǔ)[7]。研究表明，菌株麗猴1號的子實(shí)體菜花狀、顏色對光極敏感、菌刺細(xì)密多分支，與栽培品種的子實(shí)體性狀具有明顯差異，種質(zhì)特色鮮明，為首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道；遺傳差異分析和甲醇提取物的液相色譜圖差異性表明其與栽培品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；該種質(zhì)來源于云南香格里拉，遠(yuǎn)離猴頭菇栽培產(chǎn)區(qū)，推測其為Hericium erinaceus地理亞種。菌株麗猴1號的特殊子實(shí)體性狀及與栽培品種較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，適合作為育種親本，可通過雜交技術(shù)對栽培品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良，也可以通過馴化選育和栽培技術(shù)優(yōu)化定向開發(fā)為特色種質(zhì)，也是研究子實(shí)體性狀與基因協(xié)調(diào)表達(dá)關(guān)系的理想材料。

營養(yǎng)和活性成分是猴頭菌品質(zhì)評價(jià)的重要指標(biāo)，菌株麗猴1號的蛋白質(zhì)、脂肪、粗多糖含量均高于栽培品種，麥角甾醇含量高于菌株猴頭99，表明菌株麗猴1號是品質(zhì)性狀較優(yōu)的特色猴頭菌種質(zhì)資源，可以利用其營養(yǎng)和活性成分含量高的優(yōu)勢用于功能性食品、保健品和藥品的開發(fā)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菌中含有吡喃酮類、萜類、酚類、甾體、生物堿類化合物等不同類型的次生代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)神經(jīng)生長因子合成、保護(hù)胃黏膜等生理活性[20]。本研究中菌株麗猴1號甲醇提取物的液相色譜圖顯示其出峰數(shù)量多，表明其可能具有較豐富的次生代謝產(chǎn)物，后續(xù)可以對其猴頭菌素、猴頭菌酮等活性成分進(jìn)行深入研究，充分挖掘種質(zhì)特性并加以利用。

野生種質(zhì)具有很多栽培品種所不具備的優(yōu)異性狀，是優(yōu)良的基因?qū)殠?。在猴頭菌遺傳和育種研究中，應(yīng)盡可能多收集野生種質(zhì)資源并對其表型性狀、品質(zhì)性狀及性狀協(xié)調(diào)表達(dá)關(guān)系等進(jìn)行深入研究，為優(yōu)良品種選育提供豐富的種質(zhì)資源儲備。