李春霞，劉靜雯，李欣悅，王竟夷，黃 亮，班立桐，孫 寧，王 玉

（天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus） 又名蟹味菇、斑玉蕈等，隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 玉蕈屬 （Hypsizigus）[1]。真姬菇在栽培過(guò)程中菌絲生長(zhǎng)速度慢、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、易受栽培環(huán)境的影響[2]，且栽培基質(zhì)中含有大量木質(zhì)素和纖維素，在降解纖維素前必須先降解木質(zhì)素，漆酶在木質(zhì)素的降解過(guò)程中起主要作用[3-4]。近年來(lái)，許多研究者開(kāi)始借助平板篩選法以獲得木質(zhì)素降解酶活性高的菌株以期縮短食用菌生長(zhǎng)周期[5-6]。通過(guò)采用平板篩選獲得木質(zhì)素降解酶活性高的菌株，旨在為真姬菇工廠化栽培提供新的優(yōu)質(zhì)菌株，提高子實(shí)體產(chǎn)量。

常壓室溫等離子體誘變技術(shù)（atmospheric room temperature plasma,ARTP） 可以使微生物表面電勢(shì)下降或者改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)發(fā)生損傷，生物細(xì)胞中容錯(cuò)率高的SOS修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)，使得調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、造成遺傳物質(zhì)及代謝途徑發(fā)生改變[7-8]。與傳統(tǒng)誘變技術(shù)相比，ARTP誘變技術(shù)具有普適、高效、快速、安全、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)[9]；ARTP誘變技術(shù)近年來(lái)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、霉菌[10-14]，此外，在食用菌菌株篩選及育種工作中也有應(yīng)用[15-16]。通過(guò)對(duì)真姬菇菌株原生質(zhì)體的常壓室溫等離子體誘變技術(shù)進(jìn)行探索，以篩選出漆酶高產(chǎn)菌株，可為規(guī)?；恼婕Ч缴a(chǎn)提供助力。

1 材料及方法

1.1 試驗(yàn)菌株

真姬菇菌株（編號(hào)O-T），保藏于天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

1.2 主要培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、RB-PDA培養(yǎng)基、再生培養(yǎng)基配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[17-18]。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na培養(yǎng)基） 配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[19]；LBL液體培養(yǎng)基配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[20]。

1.3 主要儀器及試劑

木聚糖：山毛櫸木木聚糖純度90%，上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素，上海生工生物工程有限公司；ABTS，北京索萊寶科技有限公司；溶壁酶lywallzyme，廣東微生物研究所研制。

ARTP-M常壓室溫等離子體育種機(jī)，無(wú)錫思清源生物科技公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.4 原生質(zhì)體制備

原生質(zhì)體制備參照參考文獻(xiàn)[21]并稍加改動(dòng)，稱取15 mg溶壁酶溶于1 mL的0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，用接種環(huán)挑取適量菌體于0.6 mol·L-1的甘露醇溶液中清洗，清洗后的菌體用無(wú)菌濾紙迅速擦干放入酶液中，30℃酶解3 h，酶解結(jié)束后2 000 r·min-1離心5 min，用移液槍吸取上清，用0.6 mol·L-1的甘露醇溶液重新懸浮，用塞脫脂棉的無(wú)菌注射器純化原生質(zhì)體，400倍下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并將原生質(zhì)體濃度稀釋為1×106個(gè)/mL，添加終濃度為5%的甘油作為保護(hù)劑，得到的原生質(zhì)體懸浮液用于ARTP誘變。

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)分別研究酶解溫度（28℃、30℃、32℃、34℃）、酶解時(shí)間（2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h）、滲穩(wěn)劑種類（甘露醇、蔗糖、氯化鉀、硫酸鎂）、溶壁酶的濃度 （10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1）對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。

1.5 常壓室溫等離子體誘變

利用常壓室溫等離子體育種機(jī)對(duì)真姬菇原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，原生質(zhì)體懸浮液的上樣量為10 μL，誘變功率為120 W，輻照距離2 mm，氣體流速10 L·min-1，誘變時(shí)間梯度分別為 0、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s，每個(gè)梯度3組重復(fù)，將誘變后的原生質(zhì)體懸浮液用0.6 mol·L-1的甘露醇原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑稀釋并涂布于再生培養(yǎng)基中，計(jì)算致死率。原生質(zhì)體致死率（F，%）的計(jì)算公式為：

式中：A為對(duì)照平板菌落數(shù)（個(gè)）；B為誘變后存活菌落數(shù)（個(gè)）。

1.6 菌株篩選

1.6.1 菌株初篩

待再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)出零星小菌落時(shí)，將菌落挑至PDA培養(yǎng)基上，距離菌落1 cm處斜插入無(wú)菌蓋玻片，25℃培養(yǎng)，待邊緣菌絲生長(zhǎng)至蓋玻片2/3處時(shí)取出鏡檢，區(qū)分單核菌株和雙核菌株，測(cè)定誘變后的雙核菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、濃密度、潔白度、邊緣整齊度；挑選優(yōu)勢(shì)菌株分別接種于RB-PDA培養(yǎng)基及以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的平板培養(yǎng)基中，分別篩選出產(chǎn)漆酶和纖維素酶酶能力較高的優(yōu)勢(shì)菌株。

1.6.2 菌株復(fù)篩

采用LBL液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)，25℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)20 d后于615 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算脫色率 （decolorizing rate，DR）。脫色率（DR，%） 的計(jì)算公式為：

式中：A為菌株培養(yǎng)后培養(yǎng)基的吸光度值；B為空白培養(yǎng)基的吸光度值。

1.7 真姬菇栽培料中的酶活性分析

1.7.1 粗酶液提取

取真姬菇后熟期58 d的栽培料為酶活測(cè)定的試驗(yàn)材料，稱取6 g栽培料置于50 mL離心管中，加入30 mL蒸餾水，30℃水浴2 h，過(guò)濾，離心，上清液為粗酶液。

1.7.2 漆酶酶活測(cè)定

向96孔板中依次加入0.15 mL的50 mmol·L-1的醋酸鈉緩沖液 （pH 4.2）、50 μL 酶液、0.1 mL 的1 mmol·L-1ABTS，以滅活30 min的酶液為對(duì)照。使用酶標(biāo)儀測(cè)定420 nm處5 min內(nèi)的吸光度變化。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmoL ABTS所需的酶量為一個(gè)活力單位。酶活力（E，U·mL-1）的計(jì)算公式為：

式中：N為酶液稀釋倍數(shù)；V1為漆酶酶活測(cè)定反應(yīng)體體系的終體積；V2為反應(yīng)添加的酶液體積；OD420為t時(shí)間內(nèi)反應(yīng)液在420 nm處吸光度的增加值；3.6×104為420 nm處ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)（L·mol-1cm-1）；T為反應(yīng)時(shí)間（min）；L為96孔板孔的高度（cm）。

1.7.3 纖維素酶測(cè)定

纖維素酶測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)[22]。

1.7.4 木聚糖酶活性測(cè)定

木聚糖酶測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)[22]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，通過(guò)SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 真姬菇原生質(zhì)體的酶解條件研究

2.1.1 酶解溫度對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

溫度主要影響溶壁酶活性及細(xì)胞壁的生理狀態(tài)[23]，酶解溫度對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響具有顯著性差異，見(jiàn)圖1。

圖1 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of enzymatic temperature on protoplast yield

如圖1所示，隨著溫度升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低，酶解溫度為32℃時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最大為4.50×106個(gè)/mL；酶解溫度為34℃時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量略有降低，為4.30×106個(gè)/mL，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，原因可能為酶活性略有降低，酶解效果降低，但2種酶解溫度下，原生質(zhì)體產(chǎn)量無(wú)顯著性差異，故篩選出來(lái)的最佳酶解溫度為32℃。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

不同酶解時(shí)間下真姬菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量見(jiàn)圖2。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on protoplast yield

圖2結(jié)果表明酶解時(shí)間對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響具有顯著性差異。在溶壁酶的作用下，真姬菇菌絲體逐漸變軟，原生質(zhì)體從菌絲尖端逐漸開(kāi)始釋放，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后略微降低。酶解3.5 h時(shí)釋放的原生質(zhì)體最多，達(dá)到4.70×106個(gè)/mL；隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量降低，降低原因可能是由于菌絲體酶解完全，溶壁酶導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂，故3.5 h是最佳的酶解時(shí)間。

2.1.3 滲穩(wěn)劑種類對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

滲穩(wěn)劑對(duì)維持反應(yīng)體系中原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定性至關(guān)重要[24]，滲穩(wěn)劑種類對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 滲穩(wěn)劑種類對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量的影響Fig.3 Effect of the type of osmotic stabilizer on the number of protoplasts

如圖3所示，以甘露醇作為滲穩(wěn)劑時(shí)，真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大為6.12×106個(gè)/mL；以蔗糖作為滲穩(wěn)劑時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量最少為2.92×106個(gè)/mL；以硫酸鎂和氯化鉀作為滲穩(wěn)劑時(shí)，兩者對(duì)真姬菇原生質(zhì)體的產(chǎn)量低且無(wú)顯著性差異，故真姬菇菌絲體酶解的最佳滲穩(wěn)劑為0.6 mol·L-1甘露醇。

2.1.4 溶壁酶濃度對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

不同溶壁酶濃度對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溶壁酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different lysozyme concentration on protoplast yield

如圖4所示，不同溶壁酶濃度對(duì)真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響具有顯著性差異。隨著溶壁酶濃度的增加，真姬菇原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加，其原因是由于酶分子與菌絲體的接觸增加，而當(dāng)酶濃度為25 mg·mL-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到最大，為 6.75×106個(gè)/mL，酶濃度在20 mg·mL-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量為5.18×106個(gè)/mL，在節(jié)約溶壁酶用量，且能達(dá)到誘變要求（懸浮液純化后原生質(zhì)體數(shù)量為106個(gè)/mL） 的前提下[18]，選用的溶壁酶濃度最佳為20 mg·mL-1。

2.2 真姬菇原生質(zhì)體誘變條件的研究

誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同誘變時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響Fig.5 Effect of different mutagenesis time on the fatality rate of protoplast

如圖5所示，隨著誘變時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的致死率逐漸升高。誘變時(shí)間為100 s時(shí)，原生質(zhì)體致死率達(dá)到90.3%。挑選致死率達(dá)到90%以上時(shí)仍存活的菌落于PDA培養(yǎng)基中。

2.3 雙核菌絲篩選結(jié)果

常壓室溫等離子體誘變共獲得290株再生菌株，鏡檢結(jié)果確定雙核菌株288株，單核菌株2株。采用雙核菌株進(jìn)行菌株篩選，雙核菌絲鏡檢圖見(jiàn)圖6。

圖6 雙核菌絲鏡檢圖Fig.6 Microscopy figure of dikaryotic mycelium

如圖6所示，圖中箭頭指示為鎖狀聯(lián)合菌絲，即表明所觀察菌株為雙核菌株。

2.4 菌株初篩結(jié)果

2.4.1 菌株生長(zhǎng)速度篩選結(jié)果

通過(guò)測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速度、濃密度、潔白度、邊緣整齊度共獲得30株菌絲生長(zhǎng)速度大于出發(fā)菌株，其篩選結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 誘變菌株和菌株O-T菌絲生長(zhǎng)情況Tab.1 Mycelium growth of mutant strains and strain O-T

由表1可知，獲得了30株菌絲生長(zhǎng)速度大于出發(fā)菌株O-T、且濃密度、潔白度高且邊緣整齊，其中22株誘變菌株的生長(zhǎng)速度與出發(fā)菌株O-T之間具有顯著性差異。

2.4.2 產(chǎn)酶能力較高的菌株篩選結(jié)果

將上述30個(gè)誘變菌株分別用于產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)漆酶能力的篩選，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 產(chǎn)酶能力較高的菌株篩選結(jié)果Tab.2 Screening results of strains with high enzyme production capacity

由表2可知，7株誘變菌株在以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度高于突變株，其中菌株M-105、M-50、M-65、M-212、M-56的生長(zhǎng)速度與出發(fā)菌株O-T相比具有顯著性差異。通過(guò)觀察RB-PDA平板中的顏色變化情況，篩選出產(chǎn)漆酶能力較高的菌株4株，分別為菌株M-50、M-48、M-96、M-133，其中菌株M-50產(chǎn)2種酶的能力均高于出發(fā)菌株。

2.4.3 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

將2.4.2中得到的產(chǎn)漆酶及纖維素酶能力較高的10株菌株及出發(fā)菌株O-T進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 拮抗試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Antagonistic test results

如表3所示，出發(fā)菌株O-T與誘變菌株M-94、M-96、M-53、M-133之間無(wú)拮抗反應(yīng)，誘變菌株M-65與菌株M-94、M-48、M-133之間無(wú)拮抗反應(yīng)。

2.5 菌株復(fù)篩

LBL液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 11個(gè)菌株LBL脫色檢測(cè)結(jié)果Tab.4 LBL decolorization test results of 11 strains

如表4所示，菌株M-212、M-96、M-50的脫色率顯著高于出發(fā)菌株O-T。劉洋等[25]研究表明，顯色反應(yīng)與真姬菇產(chǎn)量具有一定相關(guān)性，培養(yǎng)基顏色越淺，脫色率越高，表明該菌株的結(jié)實(shí)性越好。

2.6 栽培料中的漆酶、纖維素酶、木聚糖酶活力結(jié)果分析

以真姬菇栽培過(guò)程中后熟期58 d的栽培料為試驗(yàn)樣品，測(cè)定復(fù)篩得到的誘變菌株M-212、M-50、M-96及出發(fā)菌株O-T的產(chǎn)酶能力，酶活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 4個(gè)菌株酶活力測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of enzyme activity of 4 strains

由表5可知，3株誘變菌株產(chǎn)漆酶能力及產(chǎn)木聚糖酶能力均顯著性高于出發(fā)菌株O-T，表明這三株菌株降解木質(zhì)素、半纖維素的能力較強(qiáng)；菌株M-212、M-50降解纖維素的能力顯著高于出發(fā)菌株OT，誘變菌株M-96降解纖維素的能力略弱于出發(fā)菌株O-T。

3 結(jié)論

首次采用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)對(duì)出發(fā)菌株O-T的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，由于原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)外界誘變條件敏感，等離子體對(duì)原生質(zhì)體誘變效率高。原生質(zhì)體數(shù)量對(duì)誘變結(jié)果有很大影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選得到的最佳滲穩(wěn)劑為0.6 mol·L-1甘露醇、最佳酶解溫度為32℃、最佳酶解時(shí)間為3.5 h、最佳酶濃度為20 mg·mL-1，原生質(zhì)體數(shù)量最大可達(dá)到6.75×106個(gè)/mL，足以滿足誘變需求，該試驗(yàn)結(jié)果與已有的文獻(xiàn)結(jié)果略有差異[18,26]，造成的原因可能是不同菌株對(duì)溶壁酶的耐受能力有差別。

共獲得誘變后產(chǎn)纖維素酶能力高的菌株7株，產(chǎn)漆酶能力高的菌株4株，但與平菇等（Pleurotus ostreatus）[27-28]相比，真姬菇菌株在產(chǎn)漆酶能力的平板篩選試驗(yàn)中變色不明顯。采用2種平板篩選方法來(lái)篩選優(yōu)勢(shì)菌株，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀。近年來(lái)，諸多研究者[29-30]采用LBL脫色檢測(cè)來(lái)判斷菌種退化程度，趙楚楚等[31]對(duì)LBL菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了機(jī)理初探，表明發(fā)酵液變色與BTB作用活性物質(zhì)的含量差異有關(guān)；劉洋等[25]研究表明LBL評(píng)價(jià)方法可對(duì)與真姬菇菌種質(zhì)量相關(guān)的多個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行整合評(píng)價(jià)，進(jìn)一步證明了該方法的可靠性，且LBL質(zhì)量評(píng)價(jià)方法操作簡(jiǎn)便，具有較好的時(shí)效性，可更好的節(jié)約育種時(shí)間。

真姬菇在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量漆酶降解栽培基質(zhì)以滿足自身生長(zhǎng)發(fā)育的需求，陳輝等[32]對(duì)真姬菇不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的酶活力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)漆酶基因的表達(dá)量在后熟40 d～60 d時(shí)持續(xù)提高。通過(guò)考察后熟58 d的真姬菇栽培料中的酶活力，并以此為依據(jù)驗(yàn)證篩選出優(yōu)勢(shì)菌株；所得優(yōu)勢(shì)菌株的產(chǎn)漆酶能力明顯高于出發(fā)菌株O-T，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在基質(zhì)降解轉(zhuǎn)化能力上的優(yōu)勢(shì)，有利于菌株生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化。