浦志一 張恒柱 戚庭月 王成海

1 揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，江蘇省揚州市 225001; 2 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院超聲科; 3 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室

腦的神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，是由先天的遺傳高危因素和環(huán)境的致癌因素相互作用所導(dǎo)致的[1-2]。piRNAs是與PIWI蛋白相互作用的核糖核酸，屬于一類非編碼蛋白RNA，其核苷酸序列有24～31個[3]。近年來piRNAs的功能研究已成為研究腫瘤的熱點之一,piR-2878是piRNAs其中的一員。本研究采用RNA原位分子雜交技術(shù)檢測piR-2878在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達情況，運用統(tǒng)計學(xué)分析piR-2878表達水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理參數(shù)的相關(guān)性,并探討其臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月—2020 年10月?lián)P州大學(xué)附屬醫(yī)院(揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院和揚州大學(xué)附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科手術(shù)的87例經(jīng)病理醫(yī)師證實的膠質(zhì)瘤標(biāo)本，35例正常腦組織來源于顱腦損傷后切除和尸體解剖的腦組織?；颊吣挲g范圍9～76 歲，中位年齡為 49歲; 男56例，女31例。標(biāo)本使用及臨床資料的收集均經(jīng)揚州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2 RNA原位分子雜交(RISH)實驗及HE染色 piR-2878探針和原位雜交試劑盒購買于武漢BOSTER生物工程有限公司。主要的實驗過程參考相關(guān)文獻[4]，實驗步驟大致如下：將切片脫去石蠟至水。使用胃蛋白酶進行消化。預(yù)雜交后使用piR-2878 RNA探針進行雜交，滴加一抗后滴加二抗，最后使用DAB顯色呈棕黃色，胞核復(fù)染成藍色，透明封片，光鏡下觀察。染色結(jié)果判定:細胞中出現(xiàn)棕黃色顆?；驁F塊為piR-2878陽性細胞；光鏡下隨機選擇10個高倍視野,計算陽性細胞與總細胞數(shù)的百分率，<5%為低表達陽性組，5%～100%為高表達陽性組。分組包括正常腦組織(對照組)，膠質(zhì)瘤空白對照組(不加一抗)，膠質(zhì)瘤實驗組。 HE染色主要過程：標(biāo)本脫蠟至水；蘇木素染料染細胞核；伊紅液染胞質(zhì)；脫水封片；光學(xué)顯微鏡下鏡檢，采集圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料的統(tǒng)計運用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差及獨立樣本t檢驗；用χ2檢驗分析計數(shù)資料；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，用 Log-rank 檢驗P<0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示兩組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織常規(guī)染色 常規(guī)HE染色，經(jīng)脫水、包埋、切片和蘇木素伊紅染色后，光學(xué)顯微鏡下可見，細胞漿為紅色，疏松狀；細胞核呈藍色。腫瘤級別越高，核漿比例越小，腫瘤異型性也越明顯，高膠質(zhì)瘤組織中可見病理性核分裂象和瘤巨細胞，見圖1。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的常規(guī)HE染色(10×20)

2.2 原位雜交檢測piR-2878在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況 RISH實驗結(jié)果表明，87例膠質(zhì)瘤組織中piR-2878 RNA的陽性染色為棕黃色，大小不等、染色深淺不同的顆粒或團塊，主要定位于細胞漿中；正常腦組織中棕黃色顆粒極少，此為陰性或弱陽性表達，見圖2。膠質(zhì)瘤piR-2878陽性例數(shù)為79.31 % (69/87)；陽性百分比值為(81.2±1.3)%，明顯高于正常腦組織的(5.0±0.7)%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=36.036，P<0.05)。

圖2 piR-2878在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況(10×20)

2.3 piR-2878在膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義 對87例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床資料進行整理，重點統(tǒng)計分析piR-2878 RNA表達水平與患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間的相關(guān)性。首先將piR-2878表達水平分為兩組：低表達組和高表達組，分組依據(jù)是低表達組為陽性率≤5%，高表達組為陽性率5%～100%。統(tǒng)計結(jié)果顯示高表達的piR-2878與腫瘤級別、局部浸潤、復(fù)發(fā)明顯相關(guān)(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小均無關(guān)聯(lián)(P>0.05)，見表1。

表1 piR-2878在膠質(zhì)瘤組織中的表達及其臨床意義

2.4 piR-2878表達水平與膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后的關(guān)系 高表達組中位生存時間(OS)為19個月(四分位區(qū)間 5～33個月)，低表達組中位OS為48個月(四分位區(qū)間22～71個月)。低表達組OS均明顯長于高表達組(P<0.05)，見圖3。

圖3 piR-2878 RNA表達水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的生存曲線圖

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦部常見的腫瘤。在WHO病理學(xué)分級上，根據(jù)腫瘤的惡性程度分為兩類4個級別：低級別膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級)，為分化良好和預(yù)后佳的膠質(zhì)瘤；高級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅲ～Ⅳ級)，為低分化膠質(zhì)瘤，患者預(yù)后不佳[5-7]。腫瘤好發(fā)的部位以小腦幕為界分為幕上膠質(zhì)瘤和幕下膠質(zhì)瘤。經(jīng)過手術(shù)、放療和化療等綜合治療后Ⅰ～Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者的生存期在8～10年之間，而Ⅲ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者的生存期在1～3年不等[8]。膠質(zhì)瘤與正常腦組織分界不清，手術(shù)很難全部切除，往往會導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，最終引起患者預(yù)后不良而死亡。因此尋找新的膠質(zhì)瘤診斷方法、治療方案、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)測指標(biāo)及預(yù)后判斷指標(biāo)尤為緊迫。

piRNA是一種核苷酸數(shù)量小(20～30個)的非編碼蛋白RNA，與PIWI蛋白結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[9-10]。初始的研究表明piRNA在男性生殖細胞的功能包括調(diào)節(jié)精子的表觀遺傳和維持生殖干細胞[3]。目前，piRNA影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程已成為研究腫瘤的新熱點，許多piRNAs在惡性腫瘤組織中表達異常，并對癌癥細胞的增殖、凋亡和侵襲遷移有促進或抑制作用[11-14]。例如，郭玉蓮等人[15]研究表明在食管鱗狀細胞癌組piRNA-19166的表達水平下降，低表達的piR-19166與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM 分期密切相關(guān),提示piR-19166是食管癌的一種新腫瘤抑制基因，而Qi T等人[16]結(jié)果提示piR-19166靶向前列腺癌細胞的CTTN基因，得以抑制癌細胞浸潤和遠處轉(zhuǎn)移，其為前列腺癌早期診斷和治療的新標(biāo)志物。在多發(fā)性骨髓瘤細胞中piR-823以外泌體囊泡的形式發(fā)揮生物學(xué)作用，為運用piRNA進行預(yù)后評估提供理論基礎(chǔ)[17]。在大腸癌細胞中，piR-54265通過激活 STAT3 信號通路促進腫瘤細胞的生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及增加抗藥性，提示患者的預(yù)后不良[18]。在乳腺癌中piR-36712的表達水平越低，則患者的生存時間越短，這與乳腺癌細胞的廣泛增殖并出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。另外也有研究者通過piRNA 芯片技術(shù)在胃癌組織中鑒定出許多與胃癌相關(guān)的piRNAs，因此得出piRNA 參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程[20]。目前，還沒有文獻報道piR-2878在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達情況，其生物學(xué)活性尚未明了，這也是本課題的研究目的所在。

本文通過RISH實驗得出在膠質(zhì)瘤組織中piR-2878呈陽性表達，而在正常腦組織呈陰性表達，提示piR-2878可能是一種新的膠質(zhì)瘤促癌基因，其激活后促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。同時我們分析了piR-2878在膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)性，本實驗研究結(jié)果表明高表達的piR-2878與膠質(zhì)瘤組織的腫瘤級別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)，說明強陽性表達piR-2878的膠質(zhì)瘤腫瘤級別高，惡性程度高，患者的預(yù)后不好，這類腫瘤更容易從原發(fā)病灶向周圍組織浸潤生長，并向鄰近的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。在piR-2878表達水平與膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后的關(guān)系統(tǒng)計中，低表達piR-2878的膠質(zhì)瘤患者存活時間明顯長于高表達piR-2878的患者，這也進一步說明piR-2878可以成為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判定的一個重要指標(biāo)。至于強陽性表達piR-2878的膠質(zhì)瘤細胞有沒有抗藥性，目前還沒有實驗數(shù)據(jù)，有待于進一步實驗證實，如有抗藥性，則患者的生存時間短，死亡率高。

綜上所述， piR-2878可能作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成和患者預(yù)后判斷的一種新腫瘤標(biāo)志物。本實驗探討piR-2878在膠質(zhì)瘤中的表達情況及其臨床病理意義，為進一步研究其相關(guān)性功能提供理論依據(jù)，也為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的臨床策略。