袁樹珍 隋曉露 顧鳳娟 張艾莎 許云鵬 謝婷妃 曾啟城 鄒杰鋒 陳繼紅

廣東醫(yī)科大學深圳寶安臨床醫(yī)學院，廣東省深圳市 518100

足細胞損傷是腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制。表觀遺傳修飾參與足細胞損傷的過程，組蛋白甲基化水平變化導致炎性反應基因轉(zhuǎn)錄過程及多個相關(guān)信號通路活化異常，破壞足細胞正常結(jié)構(gòu)及其功能，導致足細胞凋亡[1]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶同源序列增強子2(Enhancer of zeste homolog 2,EZH2)催化組蛋白H3K27發(fā)生三甲基化，EPZ-6438是EZH2的抑制劑，降低組蛋白H3K27me3水平，抑制炎性基因和超氧化物歧化酶表達，減輕炎性反應和延緩腎小球疾病的進展[2]。JAK2/STAT3信號通路是細胞內(nèi)參與凋亡及炎癥信號轉(zhuǎn)導的重要通路，能被多種代謝產(chǎn)物激活，引起炎癥因子表達增多，促進足細胞凋亡，在多種腎臟疾病中發(fā)揮重要作用[3]。JAK2/STAT3信號通路活化可促進EZH2的表達，并且STAT3與EZH2的啟動子區(qū)相互結(jié)合，參與腫瘤細胞增殖等生理過程。本研究選用小鼠腎足細胞MPC5，給予EPZ-6438干預處理，觀察足細胞組蛋白H3K27me3及JAK2/STAT3信號通路水平變化，探討組蛋白H3K27me3介導JAK2/STAT3信號通路對足細胞損傷的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠腎足細胞MPC5，購自深圳市拓普生物科技公司。DMEM培養(yǎng)基，EZH2抑制劑(EPZ-6438)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自ThermoFisher公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒，RIPA裂解液。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 小鼠腎足細胞MPC5用10%胎牛血清(FBS)、1%青鏈霉素混合液DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，當足細胞密度達到90%以上時收集細胞。PBS潤洗，加入1ml 0.25%胰酶消化處理，按1/3比例傳代，傳2個10cm2平皿放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜。隨機分對照組及EZH2-組。EZH2-組給予EPZ-6438 10μm 培養(yǎng)48h。對照組給予等量PBS培養(yǎng)48h。

1.3 Western Blot法檢測足細胞組蛋白H3K27me3 收集細胞，加RIPA裂解液裂解30min，離心取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量，調(diào)整蛋白濃度為6μg/μl，上樣電泳，電壓80V跑膠25min，160V跑膠50min。取出蛋白凝膠進行轉(zhuǎn)膜(200mA，2h)。脫脂牛奶封閉后加入H3K27me3抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，采用Image J軟件分析靶蛋白帶的灰度水平。

1.4 qPCR 法檢測足細胞JAK2、STAT3mRNA 收集細胞，用Buffer RZ提取足細胞總RNA，參照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自ThermoFisher公司)說明書合成cDNA。應用實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增, 引物序列見表1，實時定量PCR反應條件為：95℃預變性15min，95℃變性10s、60℃退火延伸30s、72℃延伸30s共45個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法進行定量分析，實驗重復3次,取平均值。

表1 JAK2、STAT3的引物序列

1.5 Western Blot法檢測足細胞p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白 收集細胞，加RIPA裂解液裂解30min，離心取上清液。BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量，調(diào)整蛋白濃度為6μg/μl，上樣電泳，電壓80V跑膠25min，160V跑膠50min。取出蛋白凝膠進行轉(zhuǎn)膜(200mA，2h)。脫脂牛奶封閉后加入一抗(p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、內(nèi)參抗體，1∶1 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜。加入二抗(1∶10 000)室溫2h后進行顯色，采用Image J軟件分析靶蛋白帶的灰度水平。

1.6 ChIP-chip技術(shù)檢測組蛋白H3K27me3靶基因及富集分析 (1)文庫構(gòu)建：收集兩組處于對數(shù)生長期的細胞，使用免疫磁珠結(jié)合細胞完成分選，使用ChiTag促進H3K27me3抗體與目標蛋白結(jié)合。Trizol法提取兩組DNA，使用Nanodrop檢測DNA的純度，使用Qubit對DNA進行定量。對目標DNA進行PCR擴增，修復DNA片段及添加測序接頭后完成純化，完成文庫構(gòu)建。(2)文庫質(zhì)檢和測序：使用Agilent 2100 對文庫的插入片段長度進行檢測，排除接頭二聚體污染，使用q-PCR 對測序文庫濃度進行定量，保證樣品純度，文庫質(zhì)檢合格后于Illumina平臺測序獲取靶基因。(3)組間差異富集峰統(tǒng)計：使用MACS/PePr軟件進行組間富集峰Peak數(shù)目統(tǒng)計。(4)數(shù)據(jù)分析：利用MACS2軟件對兩組樣品進行富集分析(閾值設定為P≤0.05)，將富集峰與基因結(jié)構(gòu)元件進行基因組位置比較，確定與富集峰有直接關(guān)系的基因集進行基因注釋。(5)GO富集分析：將富集峰相關(guān)基因集通過向GO數(shù)據(jù)庫各Term形成映射，完成Term定位，應用超幾何檢驗得到在生物過程、細胞組成和分子功能方面富集的GO項目上Peak重疊基因的條目和分布情況。(6)KEGG富集分析：將富集峰相關(guān)基因集通過KEGG數(shù)據(jù)庫，應用超幾何檢驗得到在差異表達基因中顯著性富集的信號通路，并確定信號通路中呈現(xiàn)顯著性富集的基因靶點。

2 結(jié)果

2.1 足細胞組蛋白H3K27me3水平 EZH2-組足細胞組蛋白H3K27me3蛋白表達水平為0.85±0.12，對照組為1.25±0.08，EZH2-組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007<0.05)。見圖1。

圖1 組蛋白H3K27me3蛋白表達Western Blot電泳圖

2.2 JAK2/STAT3信號通路目標基因mRNA水平 與對照組相比，EZH2-組足細胞JAK2、STAT3mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組足細胞JAK2、STAT3 mRNA水平

2.3 JAK2/STAT3信號通路目標蛋白水平 與對照組相比，EZH2-組足細胞JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 兩組足細胞p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白水平

圖2 JAK2/STAT3信號通路目標蛋白表達Western Blot電泳圖

2.4 組間差異富集峰統(tǒng)計 組間差異富集峰Peak數(shù)目統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)EZH2-組有6 919條富集峰，對照組有3 273條富集峰，兩組各列舉前15條。見表4。

表4 兩組間差異富集峰(Peak)統(tǒng)計

2.5 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因GO富集分析 靶基因功能主要集中在生物過程、細胞組成、分子功能方面(P≤0.05)。見表5，圖3。其中涉及生物過程中Pigu基因呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT信號通路調(diào)控。見表6。

表6 JAK/STAT信號通路靶基因GO富集分析

2.6 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因KEGG富集分析 靶基因參與調(diào)控信號通路主要集中在細胞溶質(zhì) DNA 感應途徑、Rap1信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路和 JAK/STAT 信號通路。見表7，圖4。其中靶基因IL12rb1、IL5ra呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT 信號通路調(diào)控。見表8。

表8 JAK/STAT信號通路靶基因KEGG功能富集分析

3 討論

足細胞損傷是腎小球疾病發(fā)生進行性腎小球硬化和腎纖維化的重要因素，其發(fā)病機制包括[4-5]：(1)血流動力學變化使血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增加改變足細胞蛋白表達及分布直接損傷足細胞；(2)RAS系統(tǒng)激活可通過促進鈣離子內(nèi)流和活性氧生成導致足細胞損傷；(3)氧化應激反應通過擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，激活足細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激系統(tǒng)導致足細胞損傷；(4)表觀遺傳修飾調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程導致炎性反應基因及多個相關(guān)信號通路活化促進足細胞凋亡等。其中，表觀遺傳修飾在足細胞損傷機制具有重要作用。

表觀遺傳修飾是指非基因序列改變所致基因表達水平的變化，包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、非編碼RNA等。組蛋白甲基化是發(fā)生在N端H3和H4氨基酸殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成，維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在足細胞損傷中發(fā)揮著重要作用。EZH2是EZH基因編碼的組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶，是多梳抑制復合體2(PRC2)的一個催化亞基，聚集至啟動子區(qū)域，催化組蛋白 H3K27發(fā)生三甲基化抑制靶基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控下游炎癥反應信號通路活化過程[6]。EZH2活性減弱使組蛋白H3K27me3水平下降，對microRNA抑制作用減弱，由microRNA調(diào)控的抗氧化劑抑制劑硫氧還蛋白互作蛋白(TxnIP)表達增加，機體產(chǎn)生氧化應激損傷足細胞，提示組蛋白H3K27me3修飾水平變化參與足細胞損傷過程[7]。

足細胞損傷與多條信號通路異?；罨嚓P(guān)，如p38MAPK信號通路、TGF-β/Smad信號通路、 NLRP3炎癥小體信號通路[8]，其中JAK2/STAT3信號通路在足細胞分化、凋亡過程中起重要作用。JAK2是非受體型胞漿酪氨酸蛋白激酶，通過與受體偶聯(lián)介導細胞因子相關(guān)信號的傳遞。STAT3是DNA結(jié)合蛋白，與磷酸化酪氨酸的肽段結(jié)合被磷酸化形成二聚體，進入胞核內(nèi)與靶基因啟動子序列的特定位點結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄[9]。體內(nèi)p-STAT3過表達可上調(diào)EZH2活性顯著增強組蛋白H3K27me3表達水平，抑制抑癌基因的表達，促進腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移，提示組蛋白H3K27me3可能通過介導JAK2/STAT3信號通路參與細胞分化、凋亡過程。

圖4 組蛋白H3K27me3調(diào)控靶基因KEGG分類

本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，EZH2-組足細胞H3K27me3蛋白表達顯著下降(P<0.05)；JAK2/STAT3信號通路目標基因JAK2、STAT3mRNA 表達顯著增加(P<0.05)；JAK2/STAT3信號通路目標蛋白JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表達顯著增加(P<0.05)；組蛋白 H3K27me3 調(diào)控靶基因 GO 富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因功能主要集中在生物過程、細胞組成、分子功能方面，其中涉及生物過程中 Pigu 基因呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT信號通路調(diào)控；組蛋白H3K27me3 調(diào)控靶基因 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)靶基因參與調(diào)控信號通路主要集中在細胞溶質(zhì) DNA 感應途徑、Rap1 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路和 JAK/STAT 信號通路，其中靶基因IL12rb1、IL5ra呈現(xiàn)顯著性富集，其參與JAK/STAT 信號通路調(diào)控。組蛋白H3K27me3介導 JAK2/STAT3信號通路致足細胞損傷的可能機制如下：(1)p-STAT3屬于核轉(zhuǎn)錄因子，介導細胞內(nèi)基因表達過程。EZH2是PRC2中的一個催化亞基，聚集至啟動子區(qū)域。在各種刺激因素下，足細胞內(nèi)啟動子區(qū)域EZH2的核定位能力減弱及其活性下降，細胞內(nèi)組蛋白H3K27me3水平下降，使其染色體結(jié)構(gòu)處于疏松狀態(tài)，增強了p-STAT3與基因啟動子的結(jié)合，對TGF-β基因等促纖維化關(guān)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱[10], 與腎臟纖維化相關(guān)的炎癥介質(zhì)及細胞因子如血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor)、IL-1β、IL-18等產(chǎn)生增多，導致足細胞損傷。(2)白細胞介素5受體(IL5ra)基因編碼IL5受體的α鏈，該受體依賴腫瘤壞死因子(TNF-α)激活相關(guān)信號通路參與細胞凋亡過程[11]。炎癥因子TNF-α與IL5受體結(jié)合激活JAK/STAT通路，執(zhí)行細胞外基質(zhì)重塑和細胞凋亡。(3) 磷脂酰肌醇多糖錨定生物合成類(Pigu)基因編碼糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)酰胺酶(GPI-T)復合物的第5亞基，GPI-T主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并催化GPI錨定蛋白合成，GPI錨定蛋白是一類由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖鏈共價結(jié)合的復雜糖復合物，參與信號轉(zhuǎn)導過程。Pigu基因過度表達能上調(diào)GPI錨定蛋白水平激活JAK/STAT通路，參與細胞增殖過程[12]。(4) Pigu、IL5ra、TGF等多個基因調(diào)控JAK2/STAT3信號通路活化過程[13]。代謝產(chǎn)物與酪氨酸激酶相關(guān)受體結(jié)合激活JAK2/STAT3信號通路，組蛋白H3K27me3水平下降對靶基因抑制作用減弱，Pigu 、IL5ra、TGF等多個基因轉(zhuǎn)錄活性增強促進JAK2酪氨酸磷酸化作用增強，JAK2激活后催化受體酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾與周圍的氨基酸序列形成停泊位點(docking site)，募集更多含有SH2結(jié)構(gòu)域的STAT3蛋白到這個停泊位點。STAT3蛋白發(fā)生磷酸化修飾水平明顯增強進入細胞核內(nèi)與促纖維化等基因結(jié)合，上調(diào)TGF-β1、α-SMA等蛋白的表達，造成細胞外基質(zhì)堆積及足細胞損傷[14]。

本細胞實驗給予組蛋白甲基化酶抑制劑干預，足細胞組蛋白 H3K27me3 表達下調(diào)，JAK2/STAT3信號通路表達增強。經(jīng)組蛋白 H3K27me3靶基因富集分析提示組蛋白 H3K27me3通過調(diào)控靶基因Pigu、IL12rb1、IL5ra參與JAK2/STAT3信號通路活化，導致足細胞損傷。