郝建兵，唐杰，郝麗榮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，哈爾濱 150001)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是以進行性白蛋白尿、高血壓和進展性腎功能下降為特征的一組臨床綜合征，是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2017年我國糖尿病患者數(shù)量約占全世界患者數(shù)量的1/4(1.14億/4.25億)[1]，且30%～40%的糖尿病會逐漸發(fā)展為DKD，其中約50%進展為終末期腎病[2]，據(jù)估計，目前我國DKD患者至少3 000萬～4 000萬，終末期腎病患者1 500萬～2 000萬。DKD已逐漸成為導(dǎo)致慢性腎衰竭的重要原因[3]，但其確切發(fā)病機制尚不明確[4]，且缺乏有效的DKD改善方法。越來越多的研究認為，微RNA(microRNA，miRNA/miR)及自噬與DKD關(guān)系密切[5-8]，可能成為DKD治療的新靶點。王筱霞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，早期DKD小鼠血清和腎臟中miR-34a水平顯著升高，并與DKD存在相關(guān)性，但具體生物學(xué)功能尚不清楚。自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)4B不僅是miR-34a調(diào)控的潛在靶基因，還是調(diào)控自噬的關(guān)鍵基因。Liu等[10]在小鼠急性腎損傷模型中證實，miR-34a能夠通過ATG4B調(diào)控腎小管上皮細胞自噬水平，但miR-34a/ATG4B是否參與糖尿病腎臟損傷過程尚無報道?；谇捌谘芯緿KD和miR-34a功能的基礎(chǔ)上，推測miR-34a/ATG4B參與在DKD的發(fā)病過程，本研究擬通過db/db小鼠(一種自發(fā)性2型糖尿病小鼠)為DKD模型探討miR-34a/ATG4B在DKD腎臟自噬和氧化應(yīng)激中作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只SPF級4周齡雄性db/db小鼠和6只無特定病原體級4周齡雄性db/m小鼠(對照組)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，按要求飼養(yǎng)(溫度22～26 ℃，濕度40%～70%)，自由飲食喂養(yǎng)2周后開始實驗研究，所有實驗操作均按照哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會關(guān)于實驗動物操作標準執(zhí)行。

1.2實驗試劑 總miRNA純化試劑盒(德國QIAGEN公司生產(chǎn)，批號：217004)，總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：P0028)，miR-34a激動劑(廣州銳博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：40000542-4-5)，激動劑陰性對照物(批號：4N0000001-4-5)、miR-34a抑制劑(批號:30000542-4-5)和抑制劑陰性對照物(批號:3N0000001-4-5)購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，互補DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司生產(chǎn)，批號：18091050)，SYBR Green Ⅰ 試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司生產(chǎn)，批號：DRR041A]，ATG4B(英國Abcam公司生產(chǎn)，批號：154843)，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ(英國Abcam公司生產(chǎn)，批號：192890)，p62(英國Abcam公司生產(chǎn)，批號：109012)，β-肌動蛋白一抗(美國Santa Cruz公司生產(chǎn)，批號：47778)，小鼠尿白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶研生物科技有限公司，批號：Ek-M21271)，小鼠活性氧類(reactive oxygen species，ROS)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：ml009876-1)，小鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，批號：YS02716B)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，批號：YS02715B)，小鼠總膽固醇ELISA試劑盒(批號：SBJ-M0602)、小鼠三酰甘油ELISA試劑盒(批號：SBJ-M0617)和小鼠糖化血紅蛋白ELISA試劑盒(批號：SBJ-M0563)購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組 30只健康4周齡雄性db/db小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后采用隨機數(shù)字表法分組：模型組(無干預(yù)措施)、miR-34a激動劑組(給予尾靜脈注射miR-34a激動劑，首次劑量20 nmol，維持劑量每3天5 nmol)、miR-34a激動劑對照組(給予尾靜脈注射miR-34a激動劑陰性對照物，方法劑量同激動劑)、miR-34a拮抗劑組(給予尾靜脈注射miR-34a拮抗劑，首次劑量200 nmol，維持劑量每3天50 nmol)、miR-34a拮抗劑對照組(給予db/db糖尿病小鼠尾靜脈注射miR-34a拮抗劑陰性對照物，方法劑量同拮抗劑)，每組6只；6只db/m小鼠作為對照組，無干預(yù)措施。4周后應(yīng)用電子血糖儀(德國羅氏公司生產(chǎn)的羅康全ACCU-CHEK?Active)測量禁食不禁水6 h的靜脈空腹血糖水平(局部消毒后剪斷尾靜脈5 mm，采血0.1 mL)，血糖>16.5 mmol/L且尿白蛋白/肌酐>3 mg/mmol為DKD模型成功。通過代謝籠收集24 h尿液；測量體重，麻醉后通過心臟采血，離心后血清-80 ℃保存?zhèn)溆茫豢焖賱冸x腎臟組織并保存于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2尿白蛋白檢測 將代謝籠收集的24 h尿液以離心半徑16 cm、3 500 r/min離心20 min，棄沉淀，測量體積后混勻，取上清液，檢測小鼠尿白蛋白濃度(采用ELISA試劑盒，μg/L)以及尿液肌酐濃度(肌酐ELISA試劑盒，μmol/L)，并以尿白蛋白濃度/尿肌酐濃度(mg/mmol)表示尿白蛋白水平。

1.3.3miR-34a表達檢測 研磨組織制備組織勻漿，通過總miRNA試劑盒提取腎臟組織中的miRNA，并通過miScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備成熟miRNA模板，隨后使用實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(德國羅氏公司生產(chǎn)，型號：LightCycler 480)和Takara SYBR GreenⅠ試劑盒進行熒光定量PCR。按照Takara SYBR GreenⅠ試劑盒說明書操作，分別加入miR-34a正向引物、反向引物，U6正、反向引物(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，設(shè)定PCR參數(shù)。最后按照LightCycler480定量PCR儀數(shù)據(jù)分析軟件以U6表達水平作為內(nèi)參，分析miR-34a相對表達量。

1.3.4ATG4B和自噬標記蛋白表達檢測 研磨組織制備組織勻漿，總蛋白試劑盒提取腎臟組織中總蛋白，采用Bradford法檢測總蛋白質(zhì)含量。取50 μg蛋白樣品上樣，利用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠(Bio-Rad Mini Gel)在Bio-Rad垂直電泳槽電泳將其分離后，通過Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上使用蛋白質(zhì)印跡緩沖液在室溫封閉1 h，洗膜緩沖液清洗3次，5 min/次，加入ATG4B(1∶2 000)，p62(1∶1 000)，LC3Ⅱ(1∶1 000)，β-肌動蛋白(1∶1 000)，一抗37 ℃孵育2 h，洗膜緩沖液清洗3次，5 min/次，山羊抗小鼠/山羊抗兔紅外線熒光二抗(1∶10 000，DyLight?800)37 ℃孵育1 h，洗膜緩沖液清洗3次，5 min/次，最后利用LICOR Odyssey影像系統(tǒng)分析蛋白條帶光密度值，用ATG4B、p62、LC3Ⅱ蛋白條帶與β-肌動蛋白蛋白條帶的光密度比值表示ATG4B、p62、LC3Ⅱ蛋白的表達水平。

1.3.5氧化應(yīng)激指標檢測 稱取50 mg腎臟組織，加入適量0.9%氯化鈉溶液搗碎，以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心10 min，取上清液，利用小鼠組織ROS試劑盒，分別加入稀釋后的標準品和待測樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi),加入50 μL生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，棄洗滌液，重復(fù)操作3次，每孔加入80 μL的親和鏈霉素-辣根過氧化物酶，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min，每孔加入底物A、B各50 μL，振蕩混勻，37 ℃避光溫育10 min，迅速加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。使用SOD、MDA試劑盒檢測小鼠SOD、MDA水平，每孔加入標準品和待測樣品各50 μL，封板后37 ℃溫育30 min，棄液體，甩干，加滿洗滌液，靜置30 s棄去，重復(fù)5次，加入酶標試劑50 μL，溫育洗滌后，加入顯色試劑A和B各50 μL，37 ℃避光溫育10 min，迅速加入50 μL終止液，在450 nm波長處測定各孔的吸光度值。

1.3.6血糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油水平檢測 將凍存的小鼠血清離心，棄沉淀，取上清液至新EP管，應(yīng)用小鼠糖化血紅蛋白、總膽固醇和三酰甘油ELISA試劑盒測定糖化血紅蛋白、總膽固醇和三酰甘油水平。

2 結(jié) 果

2.1模型組與對照組體重、空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油及尿蛋白/尿肌酐水平比較 10周齡時，模型組小鼠的體重、空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油水平及尿蛋白/尿肌酐比值均高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2模型組與對照組腎臟miR-34a、自噬和氧化應(yīng)激水平比較 10周齡時，模型組腎臟miR-34a、p62蛋白、MDA和ROS水平均高于對照組，ATG4B、LC3Ⅱ、SOD水平均低于對照組(P<0.01)，見表2、圖1。

2.3miR-34a對db/db小鼠血糖、糖化血紅蛋白水平及尿白蛋白/尿肌酐比值的影響 各組db/db小鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，尿白蛋白/尿肌酐比值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-34a激動劑組尿白蛋白/尿肌酐比值明顯高于模型組，而miR-34a拮抗劑組尿白蛋白/尿肌酐比值明顯低于模型組(P<0.01)。見表3。

2.4miR-34a對db/db小鼠腎臟ATG4B、LC3Ⅱ和p62表達水平的影響 各組db/db小鼠腎臟ATG4B、LC3Ⅱ和p62表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-34a激動劑組小鼠腎臟ATG4B和自噬標記蛋白LC3Ⅱ表達低于激動劑陰性對照組，而p62蛋白表達高于激動劑陰性對照組(P<0.01)；miR-34a拮抗劑組db/db小鼠腎臟ATG4B和自噬標記蛋白LC3Ⅱ表達表達高于拮抗劑陰性對照組，而p62蛋白表達低于拮抗劑陰性對照組(P<0.01)，見表4和圖2。

2.5miR-34a對db/db小鼠腎臟中氧化應(yīng)激水平的影響 各組db/db小鼠SOD、MDA和ROS水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-34a激動劑組小鼠腎臟SOD水平低于激動劑陰性對照組，但MDA和ROS水平高于激動劑陰性對照組(P<0.01)；miR-34a拮抗劑組小鼠腎臟SOD水平高于拮抗劑陰性對照組，但MDA和ROS水平低于拮抗劑陰性對照組(P<0.01)，見表5。

表1 模型組與對照組小鼠體重、空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、三酰甘油及尿蛋白/尿肌酐水平比較

表2 模型組與對照組小鼠腎臟miR-34a、自噬和氧化應(yīng)激水平比較

ATG：自噬相關(guān)基因；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；β-actin：β-肌動蛋白

表3 五組db/db小鼠血糖、糖化血紅蛋白水平及尿白蛋白/尿肌酐比值比較

表4 四組db/db小鼠腎臟ATG4B、LC3Ⅱ和p62表達水平比較

3 討 論

生理狀態(tài)下，自噬對腎臟固有細胞(包括腎小球內(nèi)皮細胞、足細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞)具有保護作用，但在病理狀態(tài)下如高血糖可通過誘導(dǎo)自噬失調(diào)導(dǎo)致腎臟固有細胞損傷和糖尿病腎臟并發(fā)癥。既往研究顯示，早期DKD腎臟中自噬水平降低，上調(diào)自噬水平能減輕腎臟損傷[11-13]。但調(diào)控自噬水平的確切機制尚未闡明，且目前尚無有效調(diào)控自噬水平的策略。目前越來越多的研究證實，miRNA與自噬水平相互影響，參與DKD的發(fā)病過程，明確miR-34a與自噬在DKD中的作用機制有助于尋找DKD診治的新靶點[14-16]。本研究結(jié)果顯示，db/db小鼠腎臟組織中的miR-34a/ATG4B通路參與調(diào)控自噬水平，導(dǎo)致糖尿病腎臟損傷。

miR：微RNA；ATG：自噬相關(guān)基因；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；β-actin：β-肌動蛋白

表5 四組db/db小鼠腎臟氧化應(yīng)激水平比較

miR-34s作為一類小分子單鏈非編碼RNA，通過與特定靶基因信使RNA 3′非翻譯區(qū)互補結(jié)合調(diào)控靶基因功能，參與調(diào)控多種生理病理過程，如miR-34s參與調(diào)控血管平滑肌細胞鈣化。王筱霞等[9]通過miRNA基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，早期DKD小鼠血清和腎臟中miR-34a表達顯著升高，但其確切功能，特別是與自噬的關(guān)系尚不明確。Wu等[17]對宮頸癌和卵巢腺癌細胞培養(yǎng)的研究證實，miR-34a/miR-34c-5p通過調(diào)控ATG4B表達參與雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬過程。在DKD小鼠中，腎臟組織中異常表達的miR-34a能夠通過調(diào)控腎臟組織中ATG4B蛋白表達影響自噬水平，參與糖尿病腎臟損傷過程。

ATG是調(diào)控自噬過程的重要環(huán)節(jié)，尤其是可通過促進自噬體與溶酶體融合誘導(dǎo)自噬體形成[18]。在哺乳動物細胞中，ATG4有ATG4A、ATG4B、ATG4C和ATG4D四種亞型，其中ATG4B是ATG4家族中發(fā)揮作用的主要成員，存在于細胞質(zhì)，對ATG8家族成員(LC3家族及GABA受體關(guān)聯(lián)蛋白家族)特別是LC3B的激活效率是其他三種亞型的1 500倍[19]。本研究中，miR-34a表達升高后，糖尿病小鼠腎臟組織中ATG4B、自噬水平降低，證實在腎臟中ATG4B是miR-34a發(fā)揮調(diào)控自噬作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

氧化應(yīng)激是細胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，活性氧自由基產(chǎn)生增多而清除能力減弱，氧化能力增強，導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)和功能改變，損傷細胞的病理生理過程。其中SOD是具有抗氧化作用的金屬酶，能夠清除自由基保護細胞，高血糖狀態(tài)下誘發(fā)腎臟固有細胞中SOD活性降低，ROS產(chǎn)生增多，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA產(chǎn)生增加，改變細胞蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腎臟損傷[20-21]。本研究結(jié)果證實，氧化應(yīng)激參與糖尿病腎臟損傷過程，miR-34a通過影響腎臟中氧化應(yīng)激水平誘導(dǎo)腎臟損傷。但本研究僅初步探討了糖尿病小鼠模型的miR-34a/ATG4B在DKD中的作用機制，miR-34a/ATG4B調(diào)控自噬和氧化應(yīng)激的確切機制尚未闡明。

綜上所述，在DKD小鼠模型中，miR-34a通過下調(diào)腎臟組織中ATG4B蛋白表達，抑制自噬和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎臟損傷，為DKD防治提供了新的理論基礎(chǔ)和靶點。