韓永艷, 司金春, 楊林, 趙國(guó)堯, 劉慧麗, 陳培莉△

1商丘市第一人民醫(yī)院(徐州醫(yī)科大學(xué)商丘臨床學(xué)院)重癥醫(yī)學(xué)科(河南商丘 476100)； 2商丘醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院(河南商丘 476000)

急性胰腺炎屬于臨床危重疾病，起病迅速，病死率極高可達(dá)30%以上[1]。急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前認(rèn)為胰腺腺泡中炎癥反應(yīng)是造成發(fā)病的重要原因，胰腺炎發(fā)生早期階段，胰腺腺泡細(xì)胞釋放大量的炎性因子及趨化因子，損傷細(xì)胞，且進(jìn)一步引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，因此深入探究胰腺腺泡細(xì)胞早期炎癥反應(yīng)對(duì)于闡明急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制具有重要意義[2]。p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要通路，與急性胰腺炎的發(fā)生密切相關(guān)[3]，此外p38MAPK信號(hào)通路可與核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB) 通過(guò)交互作用共同影響炎癥的發(fā)生[4]。白細(xì)胞介素(IL)-37屬于IL-1家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)重組IL-37蛋白能夠降低脂多糖(LPS)引發(fā)的炎癥反應(yīng)，然而在急性胰腺炎中的作用，目前研究不多[5]。2016年9月至2019年6月，本研究以胰腺外分泌A(yíng)R42J細(xì)胞為研究對(duì)象，轉(zhuǎn)染IL-37過(guò)表達(dá)載體后給予LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，旨在探究IL-37對(duì)AR42J細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠胰腺外分泌A(yíng)R42J細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物研究所；采取含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：10270-106，1800-022；pcDNA3.1質(zhì)粒購(gòu)于上?？吕咨锟萍加邢薰竟?，貨號(hào)：kl-zl-0650；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程公司，貨號(hào)：B518229；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：11668-017；BCA檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：H054，H007，H002；MAPK、p38MAPK抗體、IL-37抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab227426，ab4822，ab101376；NF-κB、LaminB1、β-actin抗體購(gòu)于公司，貨號(hào)SAB4501993，CLL1038，F(xiàn)3022：FC酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；3412Transwell小室購(gòu)于康寧生物器材有限公司；DSZ-70PHC光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本Carton公司；GelDocXR凝膠成像儀購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 采取含10% FBS的RPMI培養(yǎng)基在37℃ 5% CO2潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)AR42J細(xì)胞， 傳代培養(yǎng)至第3代后，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，添加不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將細(xì)胞分為3組：(1)空白組：細(xì)胞不進(jìn)行任何處理，正常培養(yǎng)；(2)陰性對(duì)照組：將pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞；(3)IL-37過(guò)表達(dá)組：將pcDNA3.1-IL-37質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞。以上3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在37℃ 5% CO2潮濕培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中添加10 μg/mL LPS，常規(guī)培養(yǎng)8 h收集上述各組細(xì)胞。

1.3.2 CCK8法檢測(cè)AR42J細(xì)胞增殖活性 收集各組細(xì)胞，添加胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種100 μL至細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，常規(guī)培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞融合度在70%時(shí)，添加10 μL CCK8檢測(cè)液，繼續(xù)孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處光密度值(OD)，并計(jì)算隔空細(xì)胞增殖率=待測(cè)組OD/空白組OD×100%，每組均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β水平 采取酶聯(lián)免疫檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，具體嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

1.3.4 AR42J細(xì)胞淀粉酶分泌率檢測(cè) 采取酶動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞中淀粉酶酶活，計(jì)算淀粉酶分泌率，淀粉酶分泌率=細(xì)胞培養(yǎng)液中淀粉酶/細(xì)胞中淀粉酶×100%。

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中p38MAPK/NF-κB蛋白表達(dá)情況 收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞蛋白，以BCA法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白，統(tǒng)一定量30 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，移至PVDF膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，經(jīng)脫脂奶粉室溫下封閉膜后，用p-p38MAPK、p38MAPK、IL-37、NF-κB、LaminB1、β-actin一抗抗體(1∶300)4℃下過(guò)夜孵育膜，洗膜后用二抗抗體(1∶5 000)室溫下溫育膜2 h，洗膜后，經(jīng)ECL發(fā)光劑曝光圖片后，采用凝膠成像掃描儀掃描蛋白條帶，以β-actin作為內(nèi)參，用Image-J軟件定量分析條帶相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37蛋白表達(dá)情況 與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞中IL-37蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

注：A：空白組；B：陰性對(duì)照組；C： IL-37過(guò)表達(dá)組

表1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中IL-37蛋白表達(dá)情況

2.2 IL-37過(guò)表達(dá)對(duì)AR42J細(xì)胞增殖活性的影響 隨著AR42J細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞增殖率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組AR42J細(xì)胞增殖抑制率比較(n=6)

2.3 IL-37過(guò)表達(dá)對(duì)AR42J細(xì)胞炎癥因子的影響 與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組AR42J細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(n=6)

2.4 IL-37過(guò)表達(dá)對(duì)淀粉酶活性的影響 與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞淀粉酶分泌率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組AR42J細(xì)胞淀粉酶活比較(n=6)

2.5 IL-37過(guò)表達(dá)對(duì)AR42J細(xì)胞p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞p38MAPK蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表5。

注：A：空白組；B：陰性對(duì)照組；C： IL-37過(guò)表達(dá)組

表5 各組AR42J細(xì)胞p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達(dá)比較(n=6)

2.6 IL-37過(guò)表達(dá)對(duì)AR42J細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的影響 與空白組與陰性對(duì)照組相比， IL-37過(guò)表達(dá)組AR42J細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞質(zhì)NF-κB蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3和表6。

注：A：空白組；B：陰性對(duì)照組；C： IL-37過(guò)表達(dá)組

表6 各組AR42J細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)比較(n=6)

3 討論

AR42J細(xì)胞屬于大鼠胰腺腺泡細(xì)胞，與人體正常胰腺腺泡細(xì)胞功能相似，能夠分泌、合成消化酶，進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)等，多用在胰腺體體外實(shí)驗(yàn)[6]。LPS屬于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，研究證實(shí)LPS參與急性胰腺炎的發(fā)病過(guò)程[7]。LPS可使輕度胰腺炎發(fā)展為重癥胰腺炎，進(jìn)一步造成系統(tǒng)炎癥綜合征的發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)LPS能夠誘導(dǎo)刺激AR42J細(xì)胞產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，且重復(fù)性較高，是研究胰腺炎良好的體外細(xì)胞模型，因此本研究也采用LPS刺激AR42J細(xì)胞復(fù)制胰腺炎細(xì)胞模型[9]。IL-37屬于抗炎因子，在胸腺、淋巴結(jié)等器官中均正常表達(dá)。在正常狀態(tài)下，IL-37呈低表達(dá)，當(dāng)受到炎癥反應(yīng)刺激后，其表達(dá)明顯升高，可抑制炎癥反應(yīng)。本研究通過(guò)將IL-37過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至AR42J細(xì)胞中孵育后給予LPS刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組、陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞所釋放的炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，空白組與陰性對(duì)照組因子水平無(wú)明顯變化，表明IL-37能夠抑制LPS誘發(fā)的炎癥因子，進(jìn)而降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

LPS能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌大量炎癥因子進(jìn)而損傷腺泡細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)小劑量的LPS能夠誘發(fā)腺泡細(xì)胞凋亡，而高劑量的LPS能夠造成細(xì)胞水腫，使胞質(zhì)膜、溶酶體破壞，進(jìn)而導(dǎo)致淀粉酶分泌升高[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組和陰性對(duì)照組相比，IL-37過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖活力升高，淀粉酶分泌率降低，推測(cè)IL-37可通過(guò)降低胰腺腺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而改善細(xì)胞活性，抑制淀粉酶過(guò)量分泌。

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在細(xì)胞中，主要參與細(xì)胞增殖、發(fā)育及胞間信號(hào)傳遞過(guò)程。MAPK通路主要包括p38 MAPK、ERK、JNK三條通路，這3條信號(hào)通路可獨(dú)立或相互交聯(lián)發(fā)揮作用[12]。其中p38MAPK通路與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，在未受到炎癥刺激時(shí)呈低表達(dá)，當(dāng)受到炎癥因子刺激后磷酸化水平升高，進(jìn)而調(diào)節(jié)各類(lèi)炎性因子表達(dá)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎大鼠中，p38MAPK磷酸化水平明顯升高，可促進(jìn)炎癥因子IL-8、TNF-α大量釋放，造成炎癥反應(yīng)失調(diào)，最終引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。此外研究發(fā)現(xiàn)采用p38 MAPK通路抑制劑處理急性胰腺炎大鼠，發(fā)現(xiàn)能夠降低機(jī)體炎癥因子水平，降低胰腺組織病理?yè)p傷[16]。這些研究均表明p38MAPK活化與胰腺炎的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組、陰性對(duì)照組相比，IL-37過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高，推測(cè)p38MAPK信號(hào)通路參與LPS誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程，IL-37可通過(guò)抑制p38MAPK通路活化，進(jìn)而抑制腺泡細(xì)胞AR42J炎癥反應(yīng)。

NF-κB廣泛參與炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)，近期發(fā)現(xiàn)NF-κB參與胰腺炎的病理發(fā)生過(guò)程，Pu等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素還能抑制LPS激活的腺泡細(xì)胞AR42J炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB的激活，進(jìn)而降低炎癥因子水平來(lái)抑制導(dǎo)管細(xì)胞化生。Pan等[18]研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激腺泡細(xì)胞AR42J后可激活NF-κB通路，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制NF-κB通路表達(dá)后可部分逆轉(zhuǎn)LPS刺激的作用。本研究發(fā)現(xiàn)與空白組、陰性對(duì)照組相比，IL-37過(guò)表達(dá)組細(xì)胞核NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低，推測(cè)NF-κB信號(hào)通路參與LPS誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞炎癥反應(yīng)，IL-37可通過(guò)抑制NF-κB通路活化，進(jìn)而抑制腺泡細(xì)胞AR42J炎癥反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)在炎癥反應(yīng)過(guò)程中NF-κB可受到p38MAPK信號(hào)通路激活，釋放大量炎癥因子進(jìn)而造成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，為局部炎癥向全身發(fā)展提供了條件[19]。Kumar等[20]研究顯示可在巨噬細(xì)胞中下調(diào)NF-κB和MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而降低TNF-α、IL-6、MCP-1和IL-1β的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)?；诖吮狙芯客茰y(cè)IL-37可能通過(guò)抑制胰腺腺泡AR42J細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制NF-κB通路活化，下調(diào)細(xì)胞炎癥因子，降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，IL-37能夠抑制LPS誘導(dǎo)AR42J細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制胰腺腺泡AR42J細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制NF-κB通路活化，下調(diào)細(xì)胞炎癥因子有關(guān)，IL-37的這一發(fā)現(xiàn)為胰腺炎治療提供新的思路，然而本研究也存在一定的不足之處，IL-37具體通過(guò)NF-κB下游哪些因子發(fā)揮抗炎作用，仍待后續(xù)深入研究。