任卉, 涂劍

岳陽(yáng)市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心(湖南岳陽(yáng) 414000)

體外受精胚胎移植過(guò)程中，通常選擇授精后(17±1)h觀察原核，正常受精卵有2個(gè)原核(2PN)，由于原核發(fā)育不同步或觀察時(shí)機(jī)局限，12%～20%的受精卵未觀察到原核(0PN)[1]。而國(guó)內(nèi)外有研究報(bào)道移植非2PN來(lái)源胚胎可獲得健康子代[2-3]。囊胚培養(yǎng)能夠淘汰部分發(fā)育潛能差及染色體異常胚胎，為提高妊娠率提供了技術(shù)條件。為了提高胚胎的利用率，在IVF新鮮周期中，未獲得2PN來(lái)源胚胎，或移植失敗后無(wú)2PN來(lái)源胚胎的患者，我中心選擇復(fù)蘇移植0PN來(lái)源囊胚。本文通過(guò)對(duì)在我中心接受0PN來(lái)源囊胚凍融移植患者的臨床妊娠結(jié)局進(jìn)行回顧性分析，評(píng)價(jià)0PN來(lái)源囊胚移植的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2019年12月在我中心接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治療，有囊胚培養(yǎng)的848例患者,鮮胚移植失敗或取消移植后，進(jìn)行凍融囊胚移植患者為研究對(duì)象。行0PN來(lái)源囊胚解凍移植患者為0PN組，同時(shí)期行解凍移植2PN來(lái)源囊胚患者為2PN組。0PN來(lái)源囊胚移植48例，2PN來(lái)源囊胚移植297例，所有周期移植胚胎數(shù)目均未超過(guò)2枚。

1.2 方法

1.2.1 胚胎觀察時(shí)間 本中心常規(guī)使用Vitrolife G5系列培養(yǎng)基。授精后(18～19 h)觀察原核 (D1)、(68±1)h觀察卵裂胚(D3)、[(116/140±2)]h觀察囊胚(D5、D6)生長(zhǎng)情況。

1.2.2 胚胎的評(píng)分和處理 (1)原核觀察：正常受精卵可觀察到2PN，未觀察到原核而后續(xù)發(fā)育成胚胎的為0PN，觀察到1個(gè)原核為單原核受精(1PN)，≥3個(gè)原核為多PN受精。(2)D3卵裂期胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Veeck等卵裂胚評(píng)估辦法，結(jié)合我中心實(shí)際操作進(jìn)行評(píng)估。Ⅰ級(jí)：卵裂球數(shù)目為7～9個(gè)，卵裂球均勻且碎片≤5%；Ⅱ級(jí)：卵裂球數(shù)目為7～12個(gè)，卵裂球均勻或大致均勻且碎片≤10%；Ⅲ級(jí)：卵裂球發(fā)育速度大致正常，卵裂球大致均勻或不均勻且碎片≤15%；Ⅳ級(jí)：胚胎發(fā)育速度異常，卵裂球不均勻且碎片≥20%。D3的Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎，均可用于移植或冷凍。(3)囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)Gardner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)囊胚擴(kuò)張狀態(tài)和孵出程度進(jìn)行分期，根據(jù)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)評(píng)分進(jìn)行分級(jí)，本中心以3BC及以上級(jí)別囊胚為可利用囊胚，4BB、4BA、4AB和4AA為優(yōu)質(zhì)囊胚。(4)在新鮮IVF周期中，我中心常規(guī)選擇1～2個(gè)2PN來(lái)源胚胎移植或冷凍，剩余Ⅲ級(jí)及以上級(jí)別2PN卵裂胚和全部0PN可用卵裂胚進(jìn)行囊胚培養(yǎng)(卵裂球數(shù)目≥4個(gè)且碎片率<20%)，根據(jù)囊胚評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，選擇可利用囊胚及優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行移植或冷凍保存，冷凍的囊胚后續(xù)在復(fù)蘇周期進(jìn)行移植。

1.2.3 囊胚的冷凍與復(fù)蘇 本中心采用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍胚胎，所用試劑為日本Kitazato公司加藤系列。將需冷凍的胚胎轉(zhuǎn)移至ES微滴靜置5～10 min；平衡后，轉(zhuǎn)移胚胎至VS微滴中靜置1 min，胚胎轉(zhuǎn)移至Cryoleaf上，然后浸入液氮中，整個(gè)過(guò)程必須<90 s。復(fù)蘇方法依照玻璃化解凍復(fù)蘇方法進(jìn)行，在液氮中拔掉Cryoleaf保護(hù)套后，將前端直接浸入WS1中1 min，觀察胚胎是否脫落下來(lái)；隨后轉(zhuǎn)移胚胎至WS2中靜置4 min；再轉(zhuǎn)入WS3中靜置4 min；轉(zhuǎn)入WS4中靜置4 min，后轉(zhuǎn)入囊胚G-2 PLUS培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2.4 胚胎移植 解凍后培養(yǎng)2 h，觀察質(zhì)量評(píng)估：囊腔復(fù)擴(kuò)完全，滋養(yǎng)層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)無(wú)退化者視為可移植囊胚，向患者交代風(fēng)險(xiǎn)并簽署知情同意書(shū)后，進(jìn)行移植，移植胚胎數(shù)≤2個(gè)。

1.3 臨床妊娠確認(rèn) 移植術(shù)后14 d行β-HCG血檢陽(yáng)性為生化妊娠；28 d后經(jīng)陰道B超監(jiān)測(cè)，可見(jiàn)孕囊和原始胎心搏動(dòng)確認(rèn)臨床妊娠。

1.4 觀察指標(biāo)計(jì)算公式 囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)；可利用囊胚形成率=可利用囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)；優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)；種植率=孕囊數(shù)/移植胚數(shù)；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植患者例數(shù)；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)；抱嬰率=獲得活產(chǎn)的患者例數(shù)/移植患者例數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同原核囊胚培養(yǎng)情況 本研究收集IVF周期中有235個(gè)周期共435枚0PN卵裂胚進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，形成優(yōu)質(zhì)囊胚118枚，優(yōu)質(zhì)囊胚率為27.13%，同時(shí)期656個(gè)周期共2 891枚2PN卵裂胚進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，形成優(yōu)質(zhì)囊胚644枚，優(yōu)質(zhì)囊胚率為22.28%。兩者囊胚形成率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，0PN來(lái)源可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于2PN來(lái)源囊胚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同原核囊胚培養(yǎng)情況比較 %(個(gè))

2.2 移植及妊娠情況 48例0PN組移植76枚囊胚，臨床妊娠33例。297例2PN組移植胚胎478枚，臨床妊娠189例。兩組年齡、移植日內(nèi)膜厚度、移植囊胚數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。0PN組的胚胎著床率(59.21 %vs52.72%)、臨床妊娠率(68.75 %vs63.64%)、流產(chǎn)率(18.18 %vs14.29%)、抱嬰率(54.17 %vs53.54%)均高于2PN組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表2 患者移植基本情況比較

表3 不同原核囊胚妊娠情況比較 %(周期)

2.3 妊娠結(jié)局 0PN組臨床妊娠33例，早期流產(chǎn)5例，1例中期引產(chǎn)，1例異位妊娠，未發(fā)生三胎妊娠。其中26例活產(chǎn)分娩，雙胎9例單胎17例(男19女15)，隨訪34個(gè)出生嬰兒均健康，未見(jiàn)畸形。

3 討論

精卵結(jié)合受精是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的生理過(guò)程。在實(shí)際臨床工作中，大部分原核在受精16～20 h可被觀察到，受精提前或延遲而錯(cuò)過(guò)原核觀察時(shí)間，受精缺陷、未參與核遺傳物質(zhì)的形成有可能導(dǎo)致0PN胚胎形成[4]。胚胎8細(xì)胞之前的發(fā)育主要由卵母細(xì)胞質(zhì)量決定，發(fā)育至融合階段后，胚胎基因組激活并決定胚胎的繼續(xù)發(fā)育。Fancsovits等[5]提出原核提早消失可能提示胚胎具有較高的質(zhì)量。囊胚培養(yǎng)作為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分，可以通過(guò)自然篩選淘汰部分染色體異常的胚胎[6]。Liao等[7]研究發(fā)現(xiàn)囊胚染色體異常率明顯低于卵裂胚。Malcov等[8]通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)鑒定分析，結(jié)果表明有57%(13/23)的0PN胚胎為是正常二倍體胚胎，6個(gè)有Y染色體，而非孤雌激活。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)移植0PN來(lái)源的新鮮卵裂期胚胎、凍融卵裂期胚胎和凍融囊胚期胚胎均有可能懷孕和活產(chǎn)[9]。鄒林兵等[10]研究表明復(fù)蘇移植0PN來(lái)源囊胚獲得了45.0% (18/40)的臨床妊娠率。101例新鮮移植0PN來(lái)源胚胎最后獲得9例的臨床妊娠，活產(chǎn)6例健康嬰兒，2例持續(xù)妊娠，1例胎停[11]。這些研究充分說(shuō)明部分0PN來(lái)源胚胎存在正常來(lái)源二倍體，具有移植可行性。

胚胎發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，目前常用的胚胎的觀察和篩選大多為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察法，即在胚胎發(fā)育的數(shù)天中幾個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)觀察胚胎。我中心IVF周期中0PN發(fā)生率為6.9%。時(shí)差成像技術(shù)(time-lapse imaging，TLI)是一種無(wú)創(chuàng)胚胎質(zhì)量評(píng)估系，與傳統(tǒng)觀察法比較，TLI既保證了培養(yǎng)微環(huán)境的穩(wěn)定，也可對(duì)胚胎在體外發(fā)育過(guò)程進(jìn)行全程監(jiān)控。通過(guò)TLI系統(tǒng)可有效觀察到原核的形成和消失過(guò)程，卵裂球分裂模式，幫助胚胎學(xué)家更加有效地評(píng)價(jià)胚胎質(zhì)量。有文獻(xiàn)表明，使用Time-lapse培養(yǎng)的2PN率要明顯高于常規(guī)培養(yǎng)組[12]。Meseguer等[13]大數(shù)據(jù)回顧性研究結(jié)果證明，應(yīng)用觀察的動(dòng)態(tài)參數(shù)挑選胚胎與傳統(tǒng)方法相比臨床妊娠率可提高約20%。

囊胚形成率和可利用囊胚率能較準(zhǔn)確地體現(xiàn)胚胎發(fā)育潛能。本研究IVF周期有囊胚培養(yǎng)848例，其中0PN胚胎獲得了與2PN胚胎相當(dāng)?shù)哪遗咝纬陕?，甚?PN來(lái)源可利用囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于2PN組，可能與第3天2PN優(yōu)質(zhì)胚胎被挑選用于新鮮移植和冷凍有關(guān)。囊胚培養(yǎng)結(jié)果說(shuō)明0PN胚胎也具有較好的發(fā)育潛能，這大大提高了卵母細(xì)胞的利用率。48例復(fù)蘇移植0PN來(lái)源囊胚的患者獲得了68.75%的臨床妊娠率，與同期復(fù)蘇移植2PN來(lái)源囊胚患者臨床妊娠(63.64%)結(jié)果相當(dāng)。移植0PN囊胚組共計(jì)出生34名嬰兒，體檢均健康未見(jiàn)異常。0PN組流產(chǎn)率雖高于2PN組(18.18%vs14.29%)，卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，數(shù)據(jù)顯示有增加的趨勢(shì)，考慮0PN來(lái)源囊胚可能存在染色體異常風(fēng)險(xiǎn)而導(dǎo)致的流產(chǎn)。上述結(jié)果表明0PN的發(fā)生并不一定是受精失敗，0PN胚胎具有良好的發(fā)育潛能，可將其培養(yǎng)至囊胚后再冷凍保存。對(duì)無(wú)2PN胚胎可利用患者來(lái)說(shuō)，0PN來(lái)源囊胚可優(yōu)先作為復(fù)蘇移植備選胚胎。

本研究不足之處，雖然移植0PN來(lái)源囊胚患者獲得了較好的臨床結(jié)局，但存在研究樣本量較少，數(shù)據(jù)可能有一定偏倚，后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量觀察。由于時(shí)差系統(tǒng)的高額經(jīng)濟(jì)成本，我中心暫未能引入臨床實(shí)際使用。后續(xù)考慮患者知情同意和經(jīng)濟(jì)可承擔(dān)基礎(chǔ)上，通過(guò)增加對(duì)0PN來(lái)源囊胚的遺傳學(xué)檢測(cè)篩查再移植，可更好地降低異常子代出生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，IVF助孕周期中未獲得正常來(lái)源胚胎，或移植失敗后已無(wú)2PN來(lái)源胚胎的患者，可選擇0PN來(lái)源囊胚進(jìn)行凍融周期移植，從而提高胚胎利用率，改善部分患者的臨床治療結(jié)局。隨著時(shí)差成像技術(shù)、植入前診斷技術(shù)等技術(shù)快速發(fā)展和應(yīng)用，可進(jìn)一步為非正常受精胚胎的利用做出有效的臨床指導(dǎo)和更加安全的治療方案。