薛婷月，廉樂樂，李婉君，薛 峰

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為革蘭氏陰性菌，其感染途徑主要是食入生或未烹飪完全的海產(chǎn)品[1]。III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）是高度組織化的多蛋白納米機(jī)器[2-4]，包括結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白以及伴侶蛋白等，在多種革蘭氏陰性菌致病過程中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)副溶血弧菌臨床分離株含有兩套T3SS[5]，包括位于1 號染色體的T3SS1 和位于2 號染色體的T3SS2，其分別表現(xiàn)細(xì)胞毒性與腸毒性[6]。T3SS1 是副溶血弧菌的重要毒力因子，但其致病機(jī)制尚未被闡明。

T3SS 要將具有毒性作用的效應(yīng)蛋白輸送到細(xì)胞內(nèi)起作用，最關(guān)鍵的一步就是要先分泌并組裝成具有運(yùn)輸功能的分泌器裝置，且只有與分泌器頂端的兩個(gè)疏水性轉(zhuǎn)位蛋白結(jié)合才能激活輸送作用[7]，而針狀蛋白在其中扮演著很重要的角色[8-9]。有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌中，菌體可將自身分泌的6 kD 左右的單體針蛋白聚合成細(xì)胞外針狀組分，從而協(xié)助菌體穿透真核質(zhì)膜而形成效應(yīng)子易位的分泌管道[10-12]。

vscF基因編碼的VscF蛋白是T3SS1 的針狀蛋白。本研究利用生物學(xué)軟件分析預(yù)測針狀蛋白VscF 線性抗原表位并選擇最優(yōu)多肽序列送至公司合成，然后與具有高度免疫原性的KLH蛋白偶聯(lián)，制備針對VscF蛋白的特異性多克隆抗體，旨在縮短常規(guī)抗原蛋白表達(dá)純化所需時(shí)間，獲得VscF 特異性多克隆抗體，為后續(xù)VscF 相關(guān)蛋白互作研究提供必要的抗體基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MBS 交 聯(lián) 劑（Maleimide-benzoic acid Nhydroxysuccinimide ester），購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；KLH 載體蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin），購自南京偉沃生物科技有限公司；DMF（N，N-二甲基甲酰胺），購自生工生物工程股份有限公司；PD-10 預(yù)裝柱、ECL 顯色液，購自GE Healthcare Life Science；VscF 肽段，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、TMB 單組分顯色液、PVDF 膜，均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；HRP-羊抗兔IgG 抗體，購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；FITC 標(biāo)記山羊抗兔Ig G（H+L），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 VscF 多肽抗原表位篩選并合成 在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索副溶血弧菌VscF蛋白序列ID，并在OptimumAntigenTM軟件輸入后檢索設(shè)計(jì)VscF 抗原多肽。綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素，選擇最優(yōu)多肽序列送金斯瑞生物公司合成。

1.2.2 MBS 法偶聯(lián)KLH 載體蛋白制備抗原KLH蛋白溶于10 mmol/L PBS 至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，4 ℃冰箱透析過夜備用。MBS 溶解于DMF 至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL。KLH 與MBS 以10:1 的體積比混合，室溫孵育30 min 后過PD-10層析柱；緩慢加樣，PB 緩沖液洗脫，收集活化的KLH 于EP 管中；將多肽溶解于PBS 并等體積與活化的KLH混合，室溫孵育3 h，4 ℃透析過夜備用。

1.2.3 免疫新西蘭兔制備多克隆抗體 將偶聯(lián)KLH 的VscF 多肽混合物與弗氏完全佐劑等體積混合，分別皮下注射免疫2 只4 月齡新西蘭大白兔，在一免后21、35 d，將制備好的抗原與弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行2 次加強(qiáng)免疫，每次免疫劑量為200 μg/只；三免15 d 后心臟采血，分離血清獲取多克隆抗體，測定抗體效價(jià)。

1.2.4 間接ELISA 測定多克隆抗體效價(jià) 采用間接免疫法檢測VscF 抗體效價(jià)，將抗原多肽用包被液稀釋成4 μg/ mL，每孔100 μL 包被酶標(biāo)板，4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3 次，10 min/次；5%脫脂乳室溫（25 ℃）封閉2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次；將上述制備的多克隆抗體血清用PBS進(jìn)行倍比稀釋，分別為1:1 000、1:2 000、1:4 000等，混勻后以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，陰性血清作為空白對照，室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次，10 min/次；向每孔中加入100 μL 經(jīng)1:5 000 稀釋的酶標(biāo)二抗（山羊抗兔-HRP），置于37 ℃恒溫箱1 h，PBST 洗板3 次；每孔加入100 μL TMB顯色液，置于37 ℃顯色 15 min；加入100 μL 2 mol/L HCl 終止反應(yīng)，即刻在酶標(biāo)儀上讀取OD450吸光值。將陽性O(shè)D450/陰性O(shè)D450≥2.1（即P/N≥2.1）時(shí)所對應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)作為抗VscF 血清效價(jià)。

1.2.5 免疫印跡法檢測VscF 多抗特異性 將實(shí)驗(yàn)室保存的VscF 原核表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，300 mA 轉(zhuǎn)60 min 至PVDF 膜，將實(shí)驗(yàn)室保存的VopS 與CyaA蛋白為陰性對照，后續(xù)封閉與洗脫參考抗體效價(jià)檢測。此處陽性抗體稀釋度選擇1:2 000，ECL 顯色液曝光。

1.2.6 多克隆抗體應(yīng)用 將副溶血弧菌野生株與ΔvscF缺失株接種至含3%氯化鈉的LB 液體培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)至對數(shù)期，1×PBS 洗2～3 次，涂抹到載玻片上，風(fēng)干，5% BSA 封閉1 h；加入VscF 多克隆抗體（稀釋度1:2 000），4 ℃孵育過夜；1×PBS 洗3～5 次，使用FITC 標(biāo)記山羊抗兔Ig G（H+L）（稀釋度1:500），室溫孵育1 h；1×PBS 洗3～5 次，使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光陽性情況及定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 VscF 多肽抗原表位篩選

利用OptimumAntigenTM軟件分析VscF蛋白序列各參數(shù)，發(fā)現(xiàn)VscF蛋白的抗原決定簇位于前半段多肽序列，而其他部位為跨膜區(qū)域（圖1）。分析結(jié)果（表1）顯示，篩選出3 條多肽，最終選擇2 號肽段由相關(guān)生物公司合成。

表1 抗原多肽設(shè)計(jì)結(jié)果

圖1 VscF蛋白序列抗原表位篩選及相關(guān)特性分析結(jié)果

2.2 多克隆抗體效價(jià)檢測

間接ELISA 法檢測3 次免疫后新西蘭兔血清中的VscF 抗體效價(jià)。檢測結(jié)果（圖2）顯示，在稀釋度為1:512 000 時(shí)，P/N（0.363/0.170）＞2.1，表明抗體效價(jià)為1:512 000。

圖2 抗VscF 血清效價(jià)檢測結(jié)果

2.3 抗體特異性檢測

采用Western Blot 法檢測血清抗體對原核表達(dá)VscF蛋白抗原抗體反應(yīng)的特異性，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)1～4 號均有蛋白樣品存在（圖3-A）；ECL 曝光結(jié)果顯示，血清抗體1:2 000 稀釋后與VscF蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而其他對照組未出現(xiàn)顯色條帶（圖3-B），表明產(chǎn)生的多肽抗體具有VscF蛋白特異性，能夠準(zhǔn)確檢測VscF蛋白。

圖3 VscF 抗體特異性檢測結(jié)果

2.4 多克隆抗體應(yīng)用

制備的多克隆抗體可通過免疫熒光來鑒定針狀蛋白VscF 在副溶血弧菌野生株（WT）與ΔvscF缺失株中的表達(dá)情況。經(jīng)誘導(dǎo)后的野生株表達(dá)針狀蛋白VscF 與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，可見紅色箭頭標(biāo)示的綠色熒光（圖4），而對照組ΔvscF則無法檢測到綠色熒光，表明VscF 多克隆抗體具有較好的反應(yīng)性和特異性，可用于針狀蛋白VscF 后續(xù)研究。

圖4 免疫熒光染色測定VscF 多克隆抗體的反應(yīng)性和特異性結(jié)果

3 討論

副溶血弧菌T3SS1 的研究主要包括效應(yīng)蛋白與結(jié)構(gòu)組裝兩個(gè)方面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)蛋白有VopQ[13-14]、VopS[15]、VPA0450[16-17]、VopR[18]，其均與細(xì)胞毒性有關(guān)。目前對T3SS1 特有的注射體結(jié)構(gòu)研究甚少。有報(bào)道顯示：VopB1（VP1657）、VopD1（VP1656）[19]是與效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)位相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白；VscI（VP1691）[20]與 YscI/HrpB 家族多個(gè)蛋白同源，參與效應(yīng)蛋白的易位過程；VscF[21]與志賀氏菌MixH、耶爾森氏菌YscF 同源，以單體形式參與組成T3SS1 胞外針狀復(fù)合體。有報(bào)道[22-23]稱，耶爾森菌T3SS 針狀復(fù)合體可為效應(yīng)蛋白運(yùn)輸提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外：Cao 等[24]在耶爾森菌屬中發(fā)現(xiàn)，YscI 通過直接與YscF 相互作用參與了針狀結(jié)構(gòu)的組裝；Souza 等[25]證明，YscF 在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定與伴侶蛋白YscE和YscG 有關(guān)，YscF、YscE 和YscG 形成可溶的異三聚體復(fù)合物，可防止YscF 在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚合。而副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF 特異性多肽抗體的制備，為進(jìn)一步研究副溶血弧菌T3SS1 針狀復(fù)合體的分泌組裝機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。此方面相關(guān)研究比較全面，還包括針狀單體蛋白聚合方式、針體尺寸、針體長度調(diào)控與分泌誘導(dǎo)方式以及復(fù)合體中相關(guān)蛋白的互作和整個(gè)結(jié)構(gòu)的組裝模式預(yù)測[26-28]。

制備多克隆抗體通常使用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，對抗原蛋白或者肽段進(jìn)行表達(dá)與純化[29-30]，后續(xù)免疫動(dòng)物，但是存在實(shí)驗(yàn)周期長、蛋白表達(dá)不可溶和蛋白純度低等問題。本研究利用合成多肽制備多克隆抗體，與傳統(tǒng)方法相比，既縮短了構(gòu)建載體與蛋白純化所需時(shí)間，又提高了蛋白純度。在綜合考慮序列長度、親水性/疏水性、表面定向性、靈活性等因素后，共篩選得到3 條備選多肽序列，其中2 號多肽序列位于N 端，更容易產(chǎn)生高性能抗體。最終生物合成了2 號多肽序列，偶聯(lián)KLH載體蛋白與免疫新西蘭兔后獲得多克隆抗體?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明，多抗純化效果較好，間接ELISA 效價(jià)比達(dá)1:512 000，顯示出VscF 多肽抗體具有良好的反應(yīng)性。Western Blot 結(jié)果顯示，在25～35 kD 有一條特異性條帶；免疫熒光染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的野生株表達(dá)針狀蛋白VscF 可與VscF 多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

綜上所述，副溶血弧菌T3SS1 針狀蛋白VscF多肽抗體制備成功，其反應(yīng)性與特異性均良好，可作為VscF 驗(yàn)證試驗(yàn)中具有特異性結(jié)合作用的抗體，這為后續(xù)副溶血弧菌T3SS1 裝置組裝機(jī)制過程中的VscF 相關(guān)蛋白互作研究提供了抗體基礎(chǔ)。