高春柳，趙勝杰，周曉翠，魏 榮，尼 博

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島嘉智生物技術(shù)有限公司，山東青島 266000；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；4.河南動物疫病預(yù)防控制中心，河南鄭州 450000；5.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081）

A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA）屬于RNA 病毒科（Picornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬（Senecavirus）成員，目前僅有一個型[1]，與心病毒屬（Cardioviruses）成員親緣關(guān)系較近[2]。SVA感染可引起豬口鼻部及冠狀帶出現(xiàn)水泡樣病變，同時可伴隨跛行、厭食、嗜睡、皮膚充血、發(fā)熱等癥狀，與口蹄疫（FMD）、豬水泡病（SVD）、水泡性口炎（VS）等疫病難以區(qū)分[3-4]。SVA 為單股正鏈RNA 病毒[5]，其基因組全長約7.3 kb，包含由666 個核苷酸組成的5'端非編碼區(qū)（UTR）。非編碼區(qū)后是1 個單一的長開放閱讀框，編碼2 181 個氨基酸組成的多聚蛋白，可被切割成12 個多肽，包括先導(dǎo)蛋白（L）、4 個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7 個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。SVA 3'端非編碼區(qū)有71 個核苷酸，后面連有poly（A）尾巴[6]。

反向遺傳技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類RNA 病毒研究。該技術(shù)可實現(xiàn)在分子水平上對病毒定向改造，為RNA 病毒基因功能及致病機理研究、新型疫苗研制等提供了有效方法[7-10]。RNA 病毒的主要反向遺傳學(xué)方法是，基于質(zhì)粒系統(tǒng)遞送病毒全長cDNA，細(xì)胞內(nèi)cDNA 能在RNA 聚合酶啟動子的作用下被轉(zhuǎn)錄成為病毒RNA，這些RNA 隨后被翻譯成多肽并被加工為成熟的病毒結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒RNA 一起包裝成具有感染性的病毒粒子。據(jù)報道[11-13]，已有的SVA 反向遺傳平臺構(gòu)建主要基于酶切連接方法，這種方法是通過RT-PCR在體外擴增病毒基因片段，利用限制性內(nèi)切酶，特異性地將片段逐個構(gòu)建到質(zhì)粒載體上，這種方法需要進行酶切、連接、單克隆鑒定、測序等復(fù)雜程序，出錯率高，耗時較長。本研究擬利用同源重組法一次性將SVA 全基因組片段、CMV 啟動子、poly（A）尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）等元件整合進低拷貝載體pWSK-29 中，構(gòu)建SVA 全長感染性克?。╬WSK-29-SVA），并拯救出與親本毒株生物學(xué)功能一致的重組病毒（rSVA），以期縮短反向遺傳平臺構(gòu)建時間，為進一步研究SVA 致病機理、研制新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞、載體 SVA-GXT91 毒株，由本實驗室分離、保存；BHK-21 細(xì)胞、pWSK-29 質(zhì)粒、EGFP N2 質(zhì)粒，為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA/DNA 核酸自動提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶、高保真DNA 聚合酶、同源重組酶、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Qiagen 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000，購自Invitrogen 公司；胎牛血清，購自金源康生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 構(gòu)建方案如下：以EGFP N2 質(zhì)粒為模板，設(shè)計含有同源臂的CMV 啟動子引物，以SVA-GXT91 RNA 為模板設(shè)計含同源臂SVA 基因全長引物（表1）。含同源臂的poly（A）尾巴+HDVr，由引物自結(jié)合擴增形成。

表1 構(gòu)建SVA 感染性克隆的引物序列

1.2.2 感染性克隆構(gòu)建 以pWSK-29 為載體，采用同源重組技術(shù)構(gòu)建pWSK-29-SVA 感染性克隆。以SVA-GXT91 RNA 為模板，擴增SVA 病毒基因片段；以引物為模板，自結(jié)合擴增poly（A）+HDVr；以EGFP N2 質(zhì)粒為模板，擴增CMV 啟動子。將pWSK-29 載體酶切線性化，與SVA 全基因組、CMV 啟動子及poly（A）+HDVr 按比例混合，在同源重組酶ExnaseMulitS 催化下，37 ℃反應(yīng)30 min 即可完成同源重組結(jié)合，實現(xiàn)體外環(huán)化。100 μL 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化后，加入10 μL構(gòu)建好的SVA 感染性克隆質(zhì)粒，輕搖混勻，冰上靜置30 min；隨即在42 ℃水浴中熱激90 s，迅速置于冰上2 min，然后置于800 μL 無抗生素的LB培養(yǎng)液中37 ℃搖床震蕩（180 r/min）45 min；以4 000 r/min 離心5 min，棄去部分上清，將剩余100 μL 液體吹吸混勻，涂布在氨芐抗性LB 培養(yǎng)板上；將培養(yǎng)板倒置在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，并于次日菌落長出后進行菌落PCR 鑒定。

1.2.3 菌落PCR 鑒定 以菌落為模板，采用2×Phanta? Max Master Mix（Dye Plus）酶進行菌落PCR 鑒定。反應(yīng)體系為：滅菌蒸餾水8.5 mL，2×Phanta?Max 12.5 mL，菌液模板2.0 mL，上下游引物各1.0 mL，共25.0 mL。反應(yīng)條件為：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)。

1.2.4 病毒拯救 在轉(zhuǎn)染前1 d，將鋪滿單層90%以上的BHK-21 細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將菌落PCR 鑒定正確的SVA 重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體Lipofectamine 3000 按照試劑盒建議的試驗方案進行轉(zhuǎn)染，同時轉(zhuǎn)染EGFP N2 質(zhì)粒觀察轉(zhuǎn)染效率，置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后觀察轉(zhuǎn)染效率；成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min 離心5 min 收獲上清，將上清重新接種于新的BHK-21 細(xì)胞，盲傳3 代（F3），觀察細(xì)胞病變情況，收集發(fā)生病變的細(xì)胞毒。

1.2.5 拯救病毒鑒定 將拯救的病毒傳至第5 代（F5），收獲病毒培養(yǎng)液，通過天隆DNA/RNA磁珠法全自動核酸提取試劑盒，采用HiScript? III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）進行反轉(zhuǎn)錄，同時清除DNA 以排除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對測序結(jié)果的干擾。依據(jù)2017年廣東SVA 全基因序列（登錄號：MG428683.1），設(shè)計7 對引物（表2），能夠擴增出部分重疊、覆蓋SVA 全基因組序列的7條片段。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反應(yīng)體系為：滅菌蒸餾水19 mL，2×Phanta?Max 25 mL，cDNA 模板2 mL，上下游引物各2 mL，共50 mL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳陽性條帶切膠后送生工生物技術(shù)公司測序。

表2 拯救病毒鑒定用引物序列

1.2.6 生長曲線分析 將傳至第5 代的拯救毒株與親本毒株（MOI=0.1）分別接種鋪滿單層BHK-21 細(xì)胞的6 孔板中，每種毒株3 次重復(fù)，吸附1 h，PBS 洗滌2 次，加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在接種后6、12、18、24 h 分別收獲病毒，測定不同時間點病毒TCID50，繪制病毒生長曲線，比較拯救毒株與親本毒株的增殖特性。

1.2.7 間接免疫熒光試驗 在12 孔板中接種BHK-21 細(xì)胞，待細(xì)胞生長至90%，分別接種rSVA 與親本毒株（MOI=0.1），同時設(shè)置陰性對照；接毒18 h 后，以4%冰冷多聚甲醛固定細(xì)胞10 min；PBS 洗滌3 次后用5% BSA 溶液封閉，孵育特異性SVA 一抗（針對VP2蛋白），PBS 洗滌后孵育FITC標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.8 噬斑形成試驗 將拯救毒株與親本毒株樣品連續(xù)10 倍稀釋后分別接種BHK-21 細(xì)胞，放置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中感染1 h；棄去病毒液，用PBS 洗滌細(xì)胞2～3 次；將低熔點瓊脂糖與2×DMEM（體積比為1:1）混合后以2 mL/孔加入6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d；在顯微鏡下觀察，當(dāng)產(chǎn)生明顯噬斑后用4%甲醛溶液固定細(xì)胞3 h，每孔加入0.5 mL 1%結(jié)晶紫室溫染色0.5 h；水洗去染色液，進行噬斑形態(tài)觀察。

2 結(jié)果

2.1 SVA 感染性克隆構(gòu)建策略

SVA 基因組全長較短，僅7.3 kb，可采用高保真酶一步法擴增。同時幾個基因元件擴增引物設(shè)計好同源臂，使pWSK-29 載體5'端到3'端依次重組進CMV、SVA 全基因組、poly（A）+HDVr（圖1）。

圖1 pWSK-29-SVA 感染性克隆示意圖

2.2 SVA 全基因組及相關(guān)基因片段PCR 擴增

如圖2 所示：以SVA-GXT91 RNA 為模板擴增出長度約為7.3 kb 的SVA 病毒基因片段；以引物為模板，通過退火自結(jié)合方式擴增出了poly（A）+HDVr；以EGFP N2 質(zhì)粒為模板，擴增出了CMV啟動子。

圖2 SVA 全基因組與poly（A）+HDVr、CMV片段PCR 擴增結(jié)果

2.3 同源重組及菌落PCR 鑒定

將pWSK-29 質(zhì)粒經(jīng)SacI/HindIII 雙酶切線性化，在同源重組酶ExnaseMulitS 催化下，將CMV啟動子、SVA 全基因組、polyA+HDVr 依次重組進pWSK-29 載體，構(gòu)建出pWSK-29-SVA 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pWSK-29-SVA 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，利用鑒定引物對菌落進行PCR 鑒定并測序。經(jīng)鑒定，所構(gòu)建的SVA 感染性克隆質(zhì)粒完全符合預(yù)期設(shè)計（圖3）。

圖3 pWSK-29-SVA 菌落PCR 鑒定結(jié)果

2.4 病毒拯救

收獲轉(zhuǎn)染后的病毒接種至新的BHK-21 細(xì)胞，48 h 后反復(fù)凍融細(xì)胞，收獲F1 代病毒。將F1 代病毒連續(xù)盲傳至F3 代，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果（圖4）顯示，出現(xiàn)典型的CPE，細(xì)胞收縮變圓，有的開始脫落，而對照細(xì)胞無變化。將拯救病毒命名為rSVA。

圖4 病毒拯救顯微鏡觀察結(jié)果

2.5 拯救病毒鑒定

F5 代rSVA 分節(jié)段PCR 擴增結(jié)果（圖5）顯示，成功擴增出預(yù)期大小的SVA 全基因組序列的7 個片段。經(jīng)測序鑒定，測序結(jié)果與親本毒株高度同源。

圖5 拯救病毒分節(jié)段PCR 鑒定結(jié)果

2.6 生長曲線分析

為比較拯救病毒與親本病毒的復(fù)制能力與增殖特性，繪制病毒生長曲線（圖6），發(fā)現(xiàn)兩種病毒的復(fù)制能力與增殖特性相似，無明顯差異。

圖6 rSVA 與親本病毒生長曲線

2.7 間接免疫熒光試驗

對親本病毒與拯救病毒進行間接免疫熒光試驗。結(jié)果（圖7）顯示：感染BHK-21 細(xì)胞18 h 后，親本病毒與拯救病毒在熒光顯微鏡下均能顯示出特異性的綠色熒光，而對照細(xì)胞沒有綠色熒光產(chǎn)生。

圖7 間接免疫熒光試驗結(jié)果

2.8 噬斑形成試驗

接種至BHK-21 細(xì)胞后，rSVA 與親本病毒均能產(chǎn)生明顯的噬斑（圖8），且噬斑大小及形態(tài)基本一致，表明拯救病毒與親本病毒具有相似的噬斑形成能力。

圖8 噬斑試驗結(jié)果

3 討論

SVA 最初從被污染的PER.C6 細(xì)胞系中分離得到。污染物被認(rèn)為源自胎牛血清或豬胰蛋白酶，早期作為溶瘤病毒而受到關(guān)注[14]。2015年SVA 在廣東省某豬場首次被發(fā)現(xiàn)并報道[15]，隨后逐漸蔓延至我國多個省份。SVA 可引起與FMD 等水泡病類似的臨床癥狀并造成巨大經(jīng)濟損失。據(jù)報道[16-17]，近年來SVA 在我國流行分布較廣泛，其診斷目前主要依賴于病原學(xué)及血清學(xué)檢測，在防控方面尚未開發(fā)出商業(yè)化疫苗。

反向遺傳操作技術(shù)在反轉(zhuǎn)錄病毒的分子特性研究中是一項重要工具[15]，為RNA 病毒在遺傳特性、疫苗構(gòu)建等方面奠定了重要基礎(chǔ)。為快速構(gòu)建SVA 感染性克隆平臺，本試驗采用快速一步法，即將SVA 全長基因組序列一次擴增，并與設(shè)計的CMV 啟動子、poly（A）+HDVr 基因相連接，同時基因上的同源臂保證3 段基因能夠依次插入線性化的低拷貝質(zhì)粒中。在同源重組酶催化下，37 ℃反應(yīng)30 min 即可一步完成同源重組結(jié)合，實現(xiàn)體外環(huán)化，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pWSK-29-SVA 直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR 鑒定，質(zhì)粒構(gòu)建正確。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21 細(xì)胞后，第1 代病變不明顯，在盲傳3 代后可出現(xiàn)明顯CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、脫落，初步表明病毒拯救成功。本研究在盲傳至第5 代時進行病毒拯救鑒定，此時能夠降低感染性克隆質(zhì)粒干擾[18]，同時使用含有去除DNA 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒可以清除殘存質(zhì)粒。通過RT-PCR 方法分7 段擴增病毒基因，并分別對擴增子進行正反兩向測序，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與親本毒株一致。為研究拯救毒株與親本毒株生物學(xué)特性的差異，本試驗比較了F5 rSVA 與親本第5 代SVA 的生長動力曲線，結(jié)果表明拯救毒株與親本毒株生長動力曲線基本一致。噬斑形成試驗顯示，拯救毒株與親本毒株產(chǎn)生噬斑大小、形狀基本一致，表明一步法構(gòu)建SVA 感染性克隆平臺準(zhǔn)確有效。

病毒感染性克隆的關(guān)鍵在于全長cDNA構(gòu)建，SVA 基因組長度較短（約7.3 kb），為單股正鏈RNA。本研究在構(gòu)建感染性克隆過程中使用高保真DNA 聚合酶，這樣能夠高效擴增基因組，并且可有效避免出現(xiàn)突變。但當(dāng)片段長度大于5 kb 時聚合酶的錯誤率呈指數(shù)級上升，因此對于較長的基因組，若擔(dān)心長片段擴增導(dǎo)致保真度降低，可將病毒基因組分成多節(jié)段進行擴增，同時設(shè)計好同源臂并確保連接正確，這樣也可實現(xiàn)快速質(zhì)粒構(gòu)建。