鄧 飛，陳弟詩(shī)，陳 斌，邵 靚，陳 冬，周莉媛，李 麗，邱明雙，丁夢(mèng)蝶

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都 610041；2.四川大學(xué)，四川成都 610065）

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）是套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬2a 亞群的一種RNA 病毒，同人類冠狀病毒、豬凝血腦脊髓炎病毒、馬冠狀病毒、鼠肝炎病毒等同屬于β-A 群[1]，可引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢以及呼吸道疾病[2-4]。新生犢牛感染BCoV 后發(fā)病率和死亡率均較高，成年牛發(fā)病率較高，但死亡率低。當(dāng)BCoV 與輪狀病毒等發(fā)生混合感染時(shí)，病死率會(huì)增加，且病愈后犢牛生長(zhǎng)、發(fā)育、生產(chǎn)性能，以及奶牛產(chǎn)奶性能等均會(huì)受到影響，并可長(zhǎng)期帶毒且在一定時(shí)期內(nèi)持續(xù)排毒，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。1985年我國(guó)首次報(bào)道了由BCoV 引起的犢牛腹瀉病例[7]。近年來(lái)的國(guó)外調(diào)查結(jié)果顯示，牛群BCoV 感染現(xiàn)象很普遍，呈世界性分布[8-10]。國(guó)內(nèi)山東、青海、西藏、新疆等?。ㄗ灾螀^(qū)）的牛群血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示BCoV 陽(yáng)性率較高[11-15]。目前有關(guān)四川省牛群BCoV 感染情況的報(bào)道主要是藏區(qū)牦牛的血清學(xué)調(diào)查[16-17]。調(diào)查結(jié)果顯示，藏區(qū)牦牛群BCoV感染現(xiàn)象很普遍。而四川省其他養(yǎng)牛地區(qū)、不同品種牛群BCoV 感染情況，尤其是病原學(xué)調(diào)查報(bào)道較缺乏。本研究對(duì)采自四川省6 個(gè)主要養(yǎng)牛市（州）的387 份腹瀉牛糞便樣品進(jìn)行了BCoV 病原檢測(cè)，以期了解四川省主要養(yǎng)牛地區(qū)的BCoV 流行情況，為牛冠狀病毒病防控策略的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年3—5 月，從四川省眉山、南充、達(dá)州、巴中、雅安、甘孜等6 個(gè)主要養(yǎng)牛市（州），采集有明顯腹瀉癥狀的發(fā)病牛糞便樣品387 份，其中眉山市30 份、南充市30 份、達(dá)州市30 份、巴中市120 份、雅安市97 份、甘孜州80 份。樣品共采自53 個(gè)場(chǎng)戶，其中規(guī)模場(chǎng)11 個(gè)、散戶42 個(gè)。樣品來(lái)源牛群種類涉及黃牛、牦牛和奶牛，其中黃牛262 份、牦牛80 份、奶牛45 份。樣品采集后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑

BCoV 熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒和磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒，均購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 核酸提取 用棉簽取適量的牛腹瀉糞便樣本放入裝有500 μL PBS 的1.5 mL EP 管中，渦旋振蕩使糞便樣本充分混勻；反復(fù)凍融3 次后，8 000 r/min 離心5 min，取200 μL 上清液，按照磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。

1.3.2 熒光RT-PCR 按BCoV 熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示：6 個(gè)市（州）53 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的387 份牛腹瀉樣品中，共有11 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的65份樣品檢出BCoV 核酸陽(yáng)性，群體陽(yáng)性檢出率為20.8%，個(gè)體陽(yáng)性檢出率為16.8%。6 個(gè)市（州）均有BCoV 陽(yáng)性樣品被檢出，其中甘孜州個(gè)體陽(yáng)性檢出率最高（28.8%），其次是巴中市（24.2%）、眉山市（16.7%）、達(dá)州市（10.0%）、南充市（6.7%），雅安市個(gè)體陽(yáng)性檢出率最低（3.1%）。

表1 不同地區(qū)牛腹瀉糞便樣品BCoV 檢測(cè)結(jié)果

2.2 場(chǎng)點(diǎn)分布

本次調(diào)查涉及6 個(gè)市（州）的53 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)，其中散養(yǎng)戶42 個(gè)、規(guī)模場(chǎng)11 個(gè)。不同場(chǎng)點(diǎn)的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示：規(guī)模場(chǎng)的群體陽(yáng)性率為72.7%，散養(yǎng)戶群體陽(yáng)性率為7.1%，差異極顯著（P＜0.01）；規(guī)模場(chǎng)個(gè)體陽(yáng)性率為21.4%，散養(yǎng)戶個(gè)體陽(yáng)性率為3.1%，差異也極顯著（P＜0.01）。

表2 不同場(chǎng)點(diǎn)牛腹瀉糞便樣品BCoV 檢測(cè)結(jié)果

2.3 品種分布

不同品種牛檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示，各地不同品種牛腹瀉糞便樣品中，牦牛樣品陽(yáng)性檢出率最高，為28.8%，其次為黃牛，陽(yáng)性檢出率為14.1%，奶牛最低，陽(yáng)性檢出率為11.1%。牦牛陽(yáng)性檢出率與黃牛、奶牛差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為P＜0.01 和P＜0.05，而奶牛與黃牛差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。

表3 不同地區(qū)各品種牛腹瀉糞便樣品的BCoV 檢測(cè)結(jié)果

3 分析與討論

四川省6 個(gè)主要養(yǎng)牛市（州）均有BCoV 陽(yáng)性樣品被檢出，結(jié)合四川省已有的調(diào)查結(jié)果[16-18]，表明BCoV 在四川省已形成一定的污染面，牛群BCoV 感染較普遍。

從采樣場(chǎng)戶類型來(lái)看，規(guī)模場(chǎng)無(wú)論是群體陽(yáng)性檢出率（72.7%）還是個(gè)體陽(yáng)性檢出率（21.4%）均顯著高于散養(yǎng)戶（7.1%和3.1%）?？赡茉蛴幸韵聝煞矫妫阂皇荁CoV 主要通過(guò)呼吸道和消化道傳播，而規(guī)模場(chǎng)飼養(yǎng)密度大，一旦發(fā)生感染，病牛未被及時(shí)隔離、環(huán)境未消毒等，就可能導(dǎo)致牛群BCoV 感染率增加；二是由于本調(diào)查只采集了腹瀉牛糞便樣品，未采集健康牛樣品，采樣場(chǎng)點(diǎn)及樣品數(shù)量較少，樣品分布不均，如散養(yǎng)戶樣品均來(lái)自雅安市，而其他市州只采集了規(guī)模場(chǎng)樣品，樣品可能缺乏代表性。

從樣品來(lái)源牛群種類來(lái)看，本調(diào)查中牦牛、黃牛和奶牛均有BCoV 陽(yáng)性樣品被檢出，與姚火春等[19]的調(diào)查結(jié)果一致，表明不同種類牛群中普遍存在BCoV 感染。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，牦牛樣品陽(yáng)性檢出率最高（28.8%），明顯高于黃牛和奶牛（14.1%和11.1%），且采樣的3 個(gè)牦牛場(chǎng)均有陽(yáng)性樣品被檢出。此前，四川省牦牛群感染BCoV 的現(xiàn)象已有多次報(bào)道。何美琳等[16]對(duì)阿壩州8個(gè)縣采集1 070 份牦牛血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BCoV抗體平均陽(yáng)性率為84.11%，且8 個(gè)縣均檢出陽(yáng)性；澤旺塔等[17]檢測(cè)了若爾蓋縣9 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)牦牛血清樣本276 份，發(fā)現(xiàn)BCoV 血清陽(yáng)性率為97.82%，且9 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的感染率普遍較高；何琪富等[18]檢測(cè)川西北草原的125 份腹瀉牦牛糞便樣本，發(fā)現(xiàn)BCoV檢出率為71.20%。以上研究及本次調(diào)查結(jié)果表明，四川省牦牛群BCoV 感染嚴(yán)重。這可能與牦牛養(yǎng)殖模式有關(guān)，高原地區(qū)牦牛多為放養(yǎng)，牛只直接暴露在糞污區(qū)域，導(dǎo)致感染概率增加。

四川是養(yǎng)牛大省，養(yǎng)牛業(yè)在畜牧經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，做好牛冠狀病毒病防控可以有效減少犢牛腹瀉造成的經(jīng)濟(jì)損失。由于目前本病尚無(wú)商品化的疫苗，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理是重要的預(yù)防措施。在日常管理中應(yīng)密切關(guān)注犢牛的生長(zhǎng)狀態(tài)，一旦發(fā)現(xiàn)犢牛腹瀉要及時(shí)采取有效的治療措施并隔離病牛。在引進(jìn)牛只時(shí)應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫，防止引入帶毒牛。同時(shí)各地應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)靥厥獾乩憝h(huán)境、不同牛種資源，制定防控BCoV 流行的有效措施。鑒于目前牛冠狀病毒病已在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)的牛群中形成一定程度的流行，建議加強(qiáng)對(duì)本病的監(jiān)測(cè)以及疫苗研發(fā)。

4 結(jié)論

調(diào)查認(rèn)為：四川省牛群中普遍存在BCoV 感染，尤其以牦牛群感染最嚴(yán)重；BCoV 已成為導(dǎo)致牛群腹瀉的重要病原之一，對(duì)其流行的控制不容忽視，需要加強(qiáng)病原監(jiān)測(cè)和疫苗研發(fā)。