王常剛， 劉 坤， 馮浩然， 蔣奕玫， 施毅卿， 陳獻(xiàn)則，宋子甲， 李 軍， 李 佑， 蔡?hào)|莉，趙 任,2

[1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（北部院區(qū)）普外科，上海 201800；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院外科，上海 200025；3.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第一婦嬰保健院臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200011]

據(jù)《全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》統(tǒng)計(jì)，2018年全球新增結(jié)腸直腸癌 (colorectal cancer，CRC)病例超過(guò)180萬(wàn)例，死亡88.1萬(wàn)例［1］。其死亡率分別列于中國(guó)和美國(guó)惡性腫瘤死亡率第5位和第2位［2］。得益于術(shù)后輔助化療/新輔助治療和手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)，CRC病人的預(yù)后在過(guò)去幾十年中有所改善，但生存率仍不高。轉(zhuǎn)移性CRC病人的5年生存率僅為14%［3］。

B7S1是B7超家族成員之一，B7S1 mRNA(又稱VTCN1)在絕大多數(shù)人惡性腫瘤中異常表達(dá)。多種實(shí)體腫瘤中B7S1表達(dá)與腫瘤表型相關(guān)，如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、腫瘤分化程度、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)浸潤(rùn)強(qiáng)度相關(guān)。利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析VTCN1在CRC的表達(dá)及其與CRC臨床特征、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及預(yù)后的相關(guān)性，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)B7S1在CRC的表達(dá)特征，為CRC免疫治療靶點(diǎn)選擇提供依據(jù)。

資料與方法

一、公共數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

本研究在6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)：①Oncomine腫瘤芯片數(shù) 據(jù) 庫(kù) (https：//www.oncomine.org/resource/login.html，查詢參數(shù)為：P<0.05,fold-change＞2以及gene ranking in ALL)； ②TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞綜合分析)；③Kaplan-Meier Plotter 數(shù) 據(jù) 庫(kù) (https：//kmplot.com/analysis/，基于薈萃分析的生存生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證)；④UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//ualcan.path.uab.edu/index.html，利用交互式網(wǎng)絡(luò)資源用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù))；⑤LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.linkedomics.org/login.php，來(lái)自32種癌癥類型和10個(gè)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟癌癥隊(duì)列的多組學(xué)數(shù)據(jù))；⑥人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.proteinatlas.org/，human protein atlas database，利用各種組學(xué)技術(shù)繪制細(xì)胞、組織和器官中的所有人類蛋白質(zhì)圖譜)，篩選評(píng)估VTCN1表達(dá)水平及其與CRC臨床病理特征和病人預(yù)后的關(guān)系。

二、標(biāo)本收集

收集2019年1月至12月間，在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 (北部院區(qū))CRC根治手術(shù)病人的腫瘤組織和距腫瘤組織邊緣＞5 cm正常組織標(biāo)本，共24例，其中男14例(結(jié)腸癌9例，直腸癌5例)，平均年齡(61.4±4.0)歲,女 10例(結(jié)腸癌5例，直腸癌 5例)，平均年齡(66.6±2.9)歲，術(shù)后病理診斷均為腺癌。標(biāo)本于4%多聚甲醛固定保存。病人為首次確診、未行放化療以及無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北部院區(qū)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

三、免疫熒光染色

①石蠟切片制備：每例取一小塊腫瘤組織及正常組織分別固定于4%多聚甲醛中，用石蠟包埋。用組織切片機(jī)切下2片厚度5～6 μm的組織，分別貼于陽(yáng)離子防脫玻片上，37℃烘箱過(guò)夜干燥。②將切片置于玻片盒，二甲苯中脫蠟、乙醇中脫水。漂洗后甩去切片上多余水分，注意防止組織過(guò)度干燥。③抗原修復(fù)：將切片置于1×抗原修復(fù)液中，95～100℃保溫20 min后，置于室溫，待抗原修復(fù)液自然冷卻至室溫。④1×PBS漂洗后用含10%驢血清的1×PBS室溫封閉30 min。⑤甩干封閉液后，加適量5%驢血清抗體稀釋液配制的一抗 (anti-human B7S1：Biolegend 公司，Cat#358101；anti-human CD45：Abcam 公司，Cat#ab10559)混合液4℃封閉過(guò)夜。⑥1×PBS漂洗，加1%驢血清適量抗體稀釋液配制的二抗［AffiniPure F(ab’)2 Fragment donkey anti-rabbit/mouse/goat immunoglobulin］混合液室溫 30 min。 ⑦1×PBS漂洗，用含DAPI的封片劑封片。⑧用Zeiss(LSM780)倒置熒光顯微成像系統(tǒng)采集圖像信息。⑨使用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Prism 6.0軟件(GraphPad)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、B7S1 mRNA在CRC中的表達(dá)水平

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析顯示，與正常組織相比，CRC的VTCN1表達(dá)在6個(gè)數(shù)據(jù)集中均增加。此外，VTCN1在宮頸癌、食管癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌中也升高，而在乳腺癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌中的表達(dá)較低(見圖1A)。為進(jìn)一步評(píng)估CRC中VTCN1表達(dá)水平差異，使用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA RNA測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證VTCN1的表達(dá)(見圖1B)。結(jié)果顯示CRC組織中VTCN1的表達(dá)明顯高于正常腸道組織。

圖1 VTCN1在不同腫瘤類型中的表達(dá)

與正常組織相比，VTCN1在多種CRC亞型中高表達(dá)，包括結(jié)腸腺癌(P=1.34×10-9)、結(jié)腸黏液腺癌(P=6.91×10-7)、盲腸腺癌(P=7.40×10-7)、直腸腺癌(P=4.56×10-10)、直腸黏液腺癌(P=0.001)、直腸乙狀結(jié)腸腺癌(P=0.019)(見表1、圖2)。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CRC組織和正常組織VTCN1的表達(dá)

表1 B7S1 mRNA在不同類型CRC中的表達(dá)水平差異（Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)）

二、B7S1 mRNA與CRC臨床病理特征的關(guān)系

從UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中的TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究VTCN1與CRC臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除Ⅱ期直腸癌(P=1.65×10-1)，其余不同分期的結(jié)腸直腸癌組織與正常組織中的VTCN1表達(dá)水平均存在顯著差異。分別為Ⅰ期結(jié)腸癌(P=7.38×10-4)、Ⅱ期結(jié)腸癌(P=1.17×10-4)、Ⅲ期結(jié)腸癌(P=1.86×10-3)、Ⅳ期結(jié)腸癌(P=4.85×10-2)，Ⅰ期直腸癌(P=4.06×10-2)、Ⅱ期直腸癌 (P=1.65×10-1)、Ⅲ期直腸癌(P=1.06×10-2)、 Ⅳ期直腸癌 (P=1.46×10-2)(見圖3)。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，亦存在一定差異。除直腸癌N0(P=1.14×10-1)，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別為結(jié)腸癌 N0(P=1.42×10-6)、N1(P=3.58×10-4)、N2(P=6.50×10-3)，直腸癌 N1(P=4.69×10-3)、N2(P=1.59×10-2)(見圖 3)。

圖3 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)查詢VTCN1與CRC不同分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

同時(shí)，通過(guò)LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)VTCN1與CRC的M分期存在一定的相關(guān)性。主要為有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人VTCN1表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)移的病人，M1與M0差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=4.98×10-2)。在CRC的錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)方面，VTCN1與其具有一定的相關(guān)性，表現(xiàn)為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(microsatellite instability-high，MSI-H)較微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellitestable，MSS)的VTCN1表達(dá)水平顯著升高(P=1.55×10-6)(見圖 4)。

圖4 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)查詢VTCN1與CRC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及MSI的關(guān)系

三、VTCN1與CRC預(yù)后的相關(guān)性

通過(guò)包含TCGA RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分析VTCN1與CRC預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示VTCN1表達(dá)水平高低與CRC的總生存率不相關(guān)(P=0.30)(見圖5A)。TNMⅢ～Ⅳ期結(jié)腸癌中，VTCN1低表達(dá)與總生存率的增加相關(guān)(P=0.008)(見圖5B)，TNM Ⅲ～Ⅳ期直腸癌中，VTCN1高表達(dá)卻相對(duì)擁有更好的總生存率(P=0.012)(見圖5C)。

在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)直腸癌VTCN1表達(dá)與總生存率的相關(guān)性作進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期直腸癌VTCN1高表達(dá)組總生存率有相對(duì)增加的趨勢(shì)。對(duì)比VTCN1低表達(dá)組及高表達(dá)組總生存率，Ⅰ期直腸癌(P=0.34)(見圖5D)和Ⅱ期直腸癌(P=0.14)(見圖5E)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅳ期直腸癌的VTCN1表達(dá)與生存率相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007 1)(見圖5G)。與此不同的是Ⅲ期直腸癌，其VTCN1低表達(dá)組預(yù)后更好 (P=0.003 2)(見圖5F)。這可能與不同CRC以及不同臨床分期腫瘤微環(huán)境相關(guān)。

圖5 人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)/Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)的VTCN1與CRC總生存率的相關(guān)性

四、VTCN1與CRC腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞/粒細(xì)胞有關(guān)

分析VTCN1與免疫細(xì)胞/粒細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，包括B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織VTCN1的表達(dá)與 B細(xì)胞 (P=1.09×10-3)、CD8+T細(xì)胞(P=7.60×10-4)、中性粒細(xì)胞(P=1.80×10-2)、樹突狀細(xì)胞(P=5.40×10-3)的浸潤(rùn)水平呈顯著正相關(guān)。直腸癌組織中VTCN1的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞 (P=1.29×10-2)、中性粒細(xì)胞(P=4.24×10-2)的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。當(dāng)然，由于結(jié)腸癌及直腸癌的腫瘤純度不顯著 (分別為P=0.05、P=0.7)，VTCN1與此6種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的具體相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

圖6 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)查詢VTCN1與CRC腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞/粒細(xì)胞的相關(guān)性

五、B7S1在CRC微環(huán)境中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異

從蛋白質(zhì)水平評(píng)估B7S1在CRC腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)。為檢測(cè)CRC腫瘤組織中B7S1的表達(dá)模式，收集24例CRC樣本，對(duì)正常腸道組織、CRC標(biāo)本進(jìn)行抗CD45、抗B7S1的免疫熒光染色。結(jié)果顯示，在腫瘤組織切片中，B7S1表達(dá)水平明顯高于正常組織(P<0.000 1)(見圖7A、B)，同時(shí)在腫瘤組織中B7S1在CD45-及CD45+免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，提示CRC組織及免疫細(xì)胞均上調(diào)表達(dá)B7S1(見圖7A)。表明B7S1可能參與CRC腫瘤免疫調(diào)控過(guò)程。

圖7 免疫熒光染色分析B7S1在CRC的表達(dá)

討 論

腫瘤免疫治療，特別是免疫檢查點(diǎn)阻斷治療成為包括CRC在內(nèi)多種實(shí)體瘤的一種極具潛力的治療手段［4］。在CRC中，腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其浸潤(rùn)程度可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)［5］。然而，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞會(huì)利用各種條件負(fù)向調(diào)控CD8+T淋巴細(xì)胞的作用，以逃避免疫監(jiān)視、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，其中包括上調(diào)共抑制性免疫檢查點(diǎn)分子［6］。免疫檢查點(diǎn)分子主要來(lái)自B7-CD28超家族和腫瘤壞死因子受體超家族。參與T淋巴細(xì)胞活化第2信號(hào)，包括共刺激性和共抑制性分子，通過(guò)增強(qiáng)或減弱T淋巴細(xì)胞受體下游信號(hào)，精確調(diào)控T細(xì)胞的激活程度和應(yīng)答強(qiáng)度。研究證實(shí)，阻斷共抑制性免疫檢查點(diǎn)分子可增強(qiáng)CD8+TIL的抗腫瘤活性并維持其高度持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)［7］。目前利用免疫檢查點(diǎn)拮抗型單抗對(duì)腫瘤進(jìn)行人工干預(yù)，以延緩CD8+T淋巴細(xì)胞衰竭，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)已在臨床上顯示明顯有效的抗腫瘤療效［4］。

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)/PD-L1單抗屬于經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)拮抗劑，目前在多種實(shí)體瘤中表現(xiàn)出持久、有效的抗癌效果［8］。研究指出，PD-1拮抗劑nivolumab和pembrolizumab在轉(zhuǎn)移性CRC病人中療效顯著。這些病人具有高水平的MSI-H或錯(cuò)配修復(fù)缺陷(different mismatch repair,dMMR)［9-10］。 然而， 由于MSI-H或dMMR在CRC中的發(fā)生率僅約15%［9］。絕大多數(shù)微衛(wèi)星穩(wěn)定或微衛(wèi)星不穩(wěn)定水平較低(microsatellite instability-low,MSI-L)的CRC病人對(duì)此類治療的應(yīng)答顯得尤為溫和［9］。因此，需針對(duì)CRC篩選出更有價(jià)值的免疫治療靶點(diǎn)。

雖然其經(jīng)典的PD-1及其配體PD-L1阻斷治療在多種實(shí)體瘤中表現(xiàn)出持久有效的廣譜抗癌效果，但僅有部分病人受益于此類治療方案［8］。因此，亟待針對(duì)特定腫瘤篩選出特異性的免疫治療靶點(diǎn)。PDL1所屬的B7家族目前已知成員包括CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1(B7-H1)、PD-L2(B7-DC 或CD273)、ICOSL(B7-H2)、CD276(B7-H3)、B7S1(B7-H4、B7x 或 Vtcn1)、VISTA (B7-H5、GI24 或 PD-1H)、B7-H6 和 B7-H7(HHLA2)［11］。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)VTCN1在CRC中的表達(dá)及其與臨床特征的相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)分析。利用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)B7S1蛋白水平在CRC腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)和分布特征。無(wú)論是mRNA還是蛋白質(zhì)水平，B7S1在正常腸道組織和CRC中均有一定程度的表達(dá)，只是在惡性腫瘤中其表達(dá)量明顯上調(diào)，說(shuō)明B7S1在CRC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。分析發(fā)現(xiàn)，VTCN1表達(dá)水平在不同類型的CRC中差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示B7S1的表達(dá)量可能受不同腫瘤微環(huán)境影響。此外，VTCN1水平與CRC的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，并與MMR狀態(tài)也存在一定聯(lián)系。在不同臨床分期或不同亞型CRC中，VTCN1表達(dá)水平和總生存率之間的相關(guān)性有一定差異。這也可能與不同腫瘤類型、不同臨床分期的腫瘤微環(huán)境差異相關(guān)。

在蛋白質(zhì)水平，與 PD-L1 類似［2］，與正常腸道組織比較，B7S1在CRC組織中表達(dá)上調(diào)。不同的是，PD-L1在 CRC中主要表達(dá)在 CD45-細(xì)胞上，而B7S1在CD45-和CD45+細(xì)胞上均有表達(dá)。在肝癌中，CD45+免疫細(xì)胞上表達(dá)的B7S1主要分布在巨噬細(xì)胞，髓樣樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞骨髓源性抑制細(xì)胞等髓樣細(xì)胞上［12］。B7S1假設(shè)性受體被誘導(dǎo)表達(dá)在活化的T淋巴細(xì)胞表面［12-13］。B7S1及其受體的表達(dá)模式，強(qiáng)烈提示B7S1在調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化中的作用。B7S1和PD-1/PD-L1聯(lián)合阻斷在肝癌動(dòng)物模型中表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)。鑒于B7S1在CRC中的特征，B7S1聯(lián)合PD-1/PD-L1阻斷治療可能是一種新的CRC治療策略。然而，包括本研究在內(nèi)的其他相關(guān)探索樣本量小，缺乏系統(tǒng)性研究。因此，需對(duì)更大樣本量的CRC病人進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)分析，以解決此重要問(wèn)題。