牛凡琪，郭斐斐，牛凡紅，劉婧，王思農(nóng)

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

痤瘡是臨床上的常見病[1]之一，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為痤瘡丙酸桿菌高度表達(dá)而誘發(fā)炎性反應(yīng)[2]。一方面，核因子（NF）-κB 信號通路[3]的表達(dá)被激活或是抑制已成為炎性反應(yīng)發(fā)生不同進(jìn)展的重要因素；另一方面，抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-37[4]通過高水平表達(dá)抑制炎性反應(yīng)[5]，在炎性反應(yīng)中起著不可替代的作用。本研究以酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測外用三黃凝膠的大鼠耳廓痤瘡模型中NF-κB和抗炎細(xì)胞因子IL-37活性表達(dá)情況，探討三黃凝膠治療痤瘡的機(jī)制[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的SPF級Wistar大鼠60只，人工喂養(yǎng)6～8周，體質(zhì)量（200±20）g，雌性∶雄性=1∶1。實驗動物許可證號：SCXK（甘）2015-001。

1.1.2 藥物和試劑 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供三黃凝膠（含3.6 g生藥/10 g）作為治療組的藥物。對照組的藥物：重慶華邦制藥股份有限公司提供0.025%維A酸乳膏（批次：H50021817）；天津市富宇精細(xì)化工有限公司提供100%油酸（批次：101212）；上海中喬新舟生物科技有限公司提供大鼠血清NF-κB試劑盒（批次：EK0531）和大鼠血清IL-37試劑盒（批次：EK0837）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 選擇60只Wistar健康大鼠，采用隨機(jī)抽樣法分6組：空白組和模型組、陽性對照組以及三黃凝膠低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組10只，除空白組，其余組建立大鼠耳廓復(fù)合痤瘡模型[7]，即在各組大鼠的右側(cè)耳廓開口處均勻外抹100%油酸，0.5 mL/次，1次/d，給藥 3 周，采用隨機(jī)抽樣法從模型組選擇2只大鼠，在無菌實驗室將大鼠的耳朵剪下，使用HE染色法處理皮損組織，觀察病理。光鏡下觀察到：增厚嚴(yán)重的角質(zhì)層，擴(kuò)張的毛囊和過度角化，并且角化皮損見于毛囊口、漏斗部，以及堵塞的角栓塞，壺狀似的擴(kuò)大和消失的皮脂腺，然后參照痤瘡組織學(xué)判定（實驗性）分級標(biāo)準(zhǔn)[8]：毛囊漏斗部無粉刺（－）；少量的密集角化皮損見于毛囊漏斗部（+）；中等量的角化皮損見于毛囊漏斗部，延伸至皮脂腺（2+）；廣泛角化皮損（和人的開放性痤瘡皮損類似）見于擴(kuò)張毛囊內(nèi)（3+）。（+）～（3+）提示大鼠耳廓的痤瘡模型已形成。

1.2.2 動物分組、給藥 在造模完成后，開始涂抹藥物。使用人和大鼠之間換算公式計算用藥劑量。給大鼠的用藥劑量為：0.025%維A酸乳膏給予陽性對照組[5 g/（kg·d）]（和換算公式計算結(jié)果一致）；給藥[0.08 g生藥/（kg·d）]（換算公式計算結(jié)果的2倍）于三黃凝膠高濃度組；給藥［0.04 g生藥/（kg·d）］（和換算公式計算結(jié)果一致）于三黃凝膠中濃度組；給藥[0.02 g生藥/（kg·d）]（換算公式計算結(jié)果的1/2倍）于三黃凝膠低濃度組。在大鼠的右耳廓造模處給藥，1次/d，給藥4周，于空白組和模型組不給藥。

1.3 肉眼、組織病理學(xué)觀察 每天觀察、記錄每組大鼠耳處造模以及用藥治療后的皮膚癥狀，最后一次外用藥24 h后，在無菌實驗室使用工具剪掉所有組的鼠耳，HE染色處理后，可以通過光鏡來觀察組織病理學(xué)變化。

1.4 NF-κB和抗炎細(xì)胞因子IL-37活性表達(dá)水平的檢測 在給藥結(jié)束后經(jīng)過24 h，采集所有大鼠心臟血，通過離心、分離技術(shù)處理血清（放置-80℃環(huán)境下，使用ELISA法檢測NF-κB和抗炎細(xì)胞因子IL-37活性表達(dá)水平。）

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示定量資料，單因素方差分析比較組間均數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 觀察造模前后皮損情況 見圖1。

圖1 使用藥物治療后的4組和未使用藥物的2組鼠耳皮膚

空白組：鼠耳部皮膚未發(fā)生明顯改變，與正常組織基本一致；顏色粉紅，質(zhì)地很柔軟，毛細(xì)血管清晰可見。大鼠的內(nèi)耳開口處：皮膚平滑，未見角化物質(zhì)和粉刺、紅腫。

模型組：觀察1周，大鼠耳部顏色微微變紅，可見許多擴(kuò)張的毛細(xì)血管，變硬、增厚的表皮。觀察2周，鼠耳皮膚變紅腫，皮溫比空白組稍高，鼠耳表皮粗糙、增厚，有脫屑、結(jié)痂現(xiàn)象。第3周，耳部皮膚比第2周紅腫更甚，皮溫也升高明顯，質(zhì)地干燥、粗糙，表皮也增厚顯著，脫屑和結(jié)痂的情況有所加重，可見隆起的丘疹。

2.2 治療后大鼠耳的皮損變化情況 使用藥物治療1周后，各治療組的鼠耳皮膚：小范圍的癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，顏色略紅，柔軟質(zhì)地，薄薄的表皮，結(jié)痂掉落，皮膚觸之無灼熱感。在給藥3周后，觀察三黃凝膠高濃度組的大鼠耳廓情況：局部觸之柔軟和光滑，顏色正常、表皮皮溫正常，沒有腫脹、脫屑、結(jié)痂。觀察三黃凝膠的低濃度組、中濃度組、陽性對照組，和模型組相比：皮損癥狀有了明顯的改善。肉眼觀察模型組，皮損沒有明顯的好轉(zhuǎn)；空白組沒有明顯的變化。

2.3 觀察組織、病理情況 見圖2。

圖2 染色處理后的鼠耳病理（HE染色×100）

空白組：大鼠耳部的表皮層：厚薄適中，可清晰看見毛囊和真皮以及表皮界限，還可見真皮層有炎性細(xì)胞存在，其他沒有明顯變化。

模型組：在造模完成后，增厚的角質(zhì)層和纖維組織、過度的角化、粗大的毛囊。廣泛角化物質(zhì)見于毛囊口、漏斗部；同時觀察到：角栓塞形成、像壺狀樣擴(kuò)大、皮脂腺的消失，并且可見炎性細(xì)胞的浸潤，和血管增厚的纖維組織。

陽性對照組：和模型組相比：可見變薄的纖維層，以及浸潤的炎性細(xì)胞、血管數(shù)量大幅度降低。

三黃凝膠組：與模型組對比，當(dāng)藥物濃度不斷增加的情況下，存在角質(zhì)層、纖維組織厚度漸漸變薄的現(xiàn)象，還有炎性細(xì)胞和血管數(shù)量同時減少。

2.4 對比各組的鼠耳廓痤瘡模型與空白組的NF-κB和IL-37活性表達(dá)情況

2.4.1 NF-κB在模型組中表達(dá)水平升高顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=194.650，P＜0.05）。對比模型組，在三黃凝膠低濃度、中濃度、高濃度組和陽性對照組中，NF-κB活性表達(dá)水平都有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=194.650，P＜0.05）。對比陽性對照組，在三黃凝膠低濃度、中濃度組中NF-κB活性表達(dá)水平相差無幾，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=194.650，P＞0.05）。三黃凝膠高濃度組的NF-κB活性表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=194.650，P＜0.05）。

2.4.2 對比空白組，IL-37在模型組中表達(dá)水平升高顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=192.090，P＜0.05）。對比模型組，在陽性對照組和三黃凝膠高濃度、中濃度、低濃度組中，IL-37水平都有明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=192.090，P＜0.05）。三黃凝膠中濃度、低濃度組和陽性對照組中IL-37水平相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=192.090，P＞0.05）。三黃凝膠高濃度組比陽性對照組中IL-37水平降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=192.090，P＜0.05）。

根據(jù)數(shù)據(jù)水平、病理和肉眼觀察比較，可以得出：三黃凝膠可以降低大鼠的NF-κB和IL-37活性表達(dá)水平，見表1。

表1 對比每組鼠耳粉刺模型NF-κB和IL-37 含量 （pg/mL，±s）

表1 對比每組鼠耳粉刺模型NF-κB和IL-37 含量 （pg/mL，±s）

注：NF-κB 中，a示與空白組比較，P 分別是 0.000、0.000、0.000、0.000、0.000；b示與模型組比較，P 分別是 0.000、0.000、0.000、0.000；c示與陽性對照組比較，P 分別是 0.903、0.951、0.000；IL-37 中，d示與空白組比較，P 分別是 0.000、0.000、0.000、0.000、0.000；e示與模型組比較，P 分別是 0.000、0.000、0.000、0.000；f示與陽性對照組比較，P分別是 0.777、0.782、0.000。

組別 n NF-κB IL-37空白組 10 22.95±1.78 15.34±2.11模型組 10 48.18±2.04a 39.91±1.44d陽性對照組 10 33.28±2.00ab 25.30±1.77de低濃度組 10 33.18±1.93abc 25.53±2.14def中濃度組 10 33.23±1.80abc 25.53±1.51def高濃度組 10 28.91±1.75abc 20.41±2.11def F 194.650 192.090 P 0.000 0.000

3 討論

痤瘡與皮膚的特發(fā)性炎性反應(yīng)密切相關(guān)，炎性因子IL-1、IL-6、IL-8的高水平表達(dá)可導(dǎo)致瘢痕的形成[9-11]。NF-κB是一種調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng)表達(dá)的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子[12]，是聯(lián)系炎性反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子。腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-8[13]等至少 27種不同炎性反應(yīng)靶基因可以被NF-κB激活，進(jìn)而產(chǎn)生大量中性粒細(xì)胞浸潤、聚積于炎性反應(yīng)部位，比如一氧化氮炎性效應(yīng)分子[14]。此外，NF-κB可以刺激IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，并且細(xì)胞因子還可以刺激NF-κB，進(jìn)一步使NF-κB活化，讓炎性反應(yīng)持續(xù)、放大[15]。同時，IL-37是新發(fā)現(xiàn)的抗炎細(xì)胞因子，由巨噬細(xì)胞刺激炎性細(xì)胞因子時產(chǎn)生，抑制炎性細(xì)胞因子的激活，在痤瘡中起到抑制炎性反應(yīng)的作用[16]。IL-37在正常情況下呈低水平表達(dá)，在痤瘡模型中炎性因子的作用下水平迅速升高，發(fā)揮作用，抑制炎性反應(yīng)[17]。IL-37通過降低IL-1α、IL-6、IL-1β、干擾素（IFN）-γ、IL-18、TNF-α 的水平來控制炎性反應(yīng)的發(fā)展[18]。

根據(jù)痤瘡組織學(xué)判定（實驗性）分級標(biāo)準(zhǔn)建立大鼠耳廓痤瘡模型，當(dāng)造模的鼠耳廓皮膚、病理學(xué)變化與人的痤瘡皮損基本一致，則說明了痤瘡模型造模的可行性?！叭S膏”常用于治療痤瘡，藥物組成：黃連、黃芩、黃柏、凡士林、芝麻油。實驗中的三黃凝膠在“三黃膏”基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行劑型轉(zhuǎn)變，以原來藥物為基礎(chǔ)，利用現(xiàn)代制作工藝，以卡波姆940作為基質(zhì)，另外增加丹參、當(dāng)歸、苦參、白及、冰片、白芷、茯苓和薄荷，將多余的色素脫去，添加（月桂氮酮）促透劑和（三乙醇胺）調(diào)節(jié)劑制作成三黃凝膠。在多年的臨床應(yīng)用中，觀察發(fā)現(xiàn)三黃凝膠在治療中、重度痤瘡方面有顯著療效[19]，能直達(dá)病位，和皮膚耦合的效果也極佳，有吸收藥物快、作用時間長、明顯改善局部皮損的優(yōu)點(diǎn)。清熱消腫是黃芩、黃柏、黃連（可以減少炎性細(xì)胞因子的釋放）共同的功效；當(dāng)歸能顯著修復(fù)皮膚創(chuàng)面，還有抗炎作用，并能降低毛細(xì)血管的通透性，使前列腺素E2（PGE2）生成減少，減輕皮膚局部炎性反應(yīng)[20-21]；丹參可以促進(jìn)組織修復(fù)、再生，皮膚局部微循環(huán)得到調(diào)節(jié)，成纖維細(xì)胞的生長得到抑制；此外，創(chuàng)傷性炎性反應(yīng)范圍可以被丹參通過免疫調(diào)節(jié)控制在適宜范圍之內(nèi)，加快修復(fù)破壞組織。

此研究證實，大鼠的耳廓痤瘡模型中NF-κB和IL-37活性表達(dá)水平能夠被三黃凝膠顯著降低。三黃凝膠的低濃度、中濃度組和陽性對照組的治療效果基本相同，三黃凝膠的高濃度組比陽性對照組的治療效果更好。因而推斷：三黃凝膠高濃度組通過降低抗炎細(xì)胞因子IL-37水平，并抑制NF-κB的活性表達(dá)，從而減少了NF與對應(yīng)炎性反應(yīng)的靶向基因結(jié)合、表達(dá)，起到治療炎性反應(yīng)的效果。