岳磊，張丹，黃麗杰，李曉靜

1.鄭州市食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

作為一種臨床常用的中成藥，三黃片是從東漢張仲景《金匱要略》中“三黃瀉心湯”的方劑中衍生而出的，最初的方劑配伍是由大黃、黃芩、黃連三味藥材組成。歷經(jīng)各版藥典收載，在《中國藥典》2015年版制法中規(guī)定，由大黃、鹽酸小檗堿和黃芩浸膏三味處方組成，具有清熱解毒，泄火通便的功能［1］。檢測標(biāo)準(zhǔn)使用HPLC 法，以三套不同的液相條件，分別針對大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿及黃芩苷分別進行含量測定，其流程繁瑣，耗時較長［2］。其他分析方法還有薄層色譜法、紫外合并紅外光譜法，HPLC 法、UPLC 法及UPLC-QTOF/MS 法。除此之外，也有使用主成分分析法針對分析結(jié)果進行統(tǒng)計分析的研究［3-9］。近年來在中藥分析領(lǐng)域，UPLC-MS/MS 法得到了更多的應(yīng)用［10-11］。質(zhì)譜檢測法在測定多種成分的時，對被測成分在液相條件下的分離度沒有強制要求，響應(yīng)更加靈敏的同時更具有針對性。通過對三黃片中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿的液相條件和質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，使之成為一種更加便捷的測定方法，可以在日常工作中幫助檢驗檢測人員有效地提高檢驗工作時的工作效率和準(zhǔn)確程度，為更全面地針對不同廠家，不同批次的三黃片進行質(zhì)量控制提供更好的技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀，型號：ACQUITY UPLC（美國Waters）；線型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號：4000 QTrap（美國Sciex）；電子分析天平，型號：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超聲波清洗機，型號：SB-800DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

對照品分別為：大黃素（110756-201512，98.7%）、大黃酚（110796-201922，99.4%）、大黃素甲醚（110758-201817，99.2%）、黃芩苷（110715-201619，93.5%）、鹽酸小檗堿（110713-201814，86.7%），均為中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；三黃片為河南省及鄭州市2018-2020年度安全監(jiān)督抽檢樣品；乙腈、甲醇（德國Merck）；甲酸（美國Fisher）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱：CORTECS UPLC C18（2.1 mm×50 mm，1.6 μm）；流動相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫程序（0～3 min，20%→90%A；3～4 min，90%A ；4～4.1 min，90% →20%A ；4.1～5 min，20%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。ESI 離子源；正、負(fù)離子實時切換掃描；多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。大黃素等5 個成分的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、腺苷和大黃素的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 混合對照品溶液制備

分別稱取5 種對照品（大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿）約10 mg（精確至0.01 mg），置于100 mL 容量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別使用移液器量取適量體積，置于10 mL 容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成混合對照品溶液，對應(yīng)各濃度分別為1.051 2 μg/mL、1.037 5 μg/mL、1.057 0 μg/mL、19.753 6 μg/mL、5.205 0 μg/mL。

2.3 供試品溶液制備

分別取不同批次三黃片各10 片，糖衣片除去包衣后研細(xì)（薄膜衣片直接研細(xì)），取約0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 錐形瓶，加入70% 甲醇50 mL，稱重（精確至0.000 1 g）。滿功率超聲30 min，取出后放至室溫，再次稱重，如出現(xiàn)重量損失的情況，添加70%甲醇直至重量與超聲前一致，搖勻后使用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

取《中國藥典》三黃片制法項下除去主藥外的空白藥用輔料約0.1 g（精確至0.000 1 g），按“2.3”項下的方法制得陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

分別取稀釋后的混合對照品溶液（精密量取混合對照品溶液5 mL，置于50 mL 容量瓶，加適量甲醇稀釋至刻度），供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.1”項下的條件進樣，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：5種目標(biāo)化合物在供試品及稀釋后的混合對照品溶液的選擇離子流圖（XIC）中在相同時間均有出峰，而陰性對照溶液XIC 圖中對應(yīng)時間均無信號干擾，專屬性強。

圖1 5種成分的提取離子流圖：A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照溶液

2.6 線性關(guān)系考察

取“2.2”項下的混合對照品溶液1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、50.00 mL（精確至0.01 mL），分別置于100 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸方程計算，各成分在對應(yīng)范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見表2。

表2 線性關(guān)系、檢測限和定量限

2.7 精密度試驗

取“2.5”項下的稀釋后的混合對照品溶液，按“2.1”項下的條件連續(xù)進樣6 次。結(jié)果顯示，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷及鹽酸小檗堿峰面積的RSD 分別為4.24%、4.45%、3.74%、2.13%、2.17%，表明儀器的精密度符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗

隨機選取同一批號的三黃片細(xì)粉（批號為1812010）6 份，平行制備6 份供試品溶液，進樣測定。測得各成分的平均含量分別為1.377 mg/片、0.373 mg/ 片、0.762 mg/ 片、16.361 mg/ 片、4.357 mg/ 片，其RSD 分別為3.89%、4.18%、4.76%、2.32%、2.18%，表明本方法重復(fù)性符合要求。

2.9 穩(wěn)定性試驗

隨機選取“2.8”項下任意一份平行樣，在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h 后測定。結(jié)果各成分的RSD 分別為4.27%、4.85%、4.61%、2.03%、2.68%，表明該供試品溶液樣品在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.10 加樣回收率試驗

稱取6 份“2.8”項下細(xì)粉各約0.05 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL 錐形瓶，再精密加入混合對照品溶液適量，按照“2.3”項下步驟制備6 份加標(biāo)供試品溶液，計算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為87.65%、90.36%、84.21%、95.83%、92.73%，其RSD 分別為2.54%、2.75%、3.31%、2.57%、2.41% 。

2.11 供試品含量測定

取10批三黃片樣品（規(guī)格均為小片，其中9批糖衣片，1批薄膜衣片），按照“2.3”項下步驟制備供試品溶液，按照“2.1”項下條件進樣，通過“2.6”項下回歸方程計算含量，結(jié)果見表3。

表3 供試品含量測定結(jié)果（mg/片）

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

相較于其他中成藥，三黃片的處方較為特殊，從制法上看，鹽酸小檗堿作為單一成分入藥，黃芩以浸膏形式入藥，且兩者用量相對較少，直接針對鹽酸小檗堿及黃芩苷進行含量測定。而大黃則是一半以浸膏形式入藥而另一半直接制成細(xì)粉入藥，且用量較大，藥典方法以大黃素和大黃酚含量之和作為綜合考量，而本文中增加了大黃素甲醚作為含量測定對象，使用液質(zhì)聯(lián)用方法，一次性針對其中的目標(biāo)成分進行檢測，從而對其進行更為全面的質(zhì)量控制研究。

3.2 提取方法的優(yōu)化

針對供試品前處理中的提取方式、選用溶劑與提取時間進行了優(yōu)化研究。其中提取方式選擇了直接超聲和回流提取，結(jié)果顯示二者提取率差異較小，而超聲提取操作較為便捷。選擇的溶劑包括甲醇、50%甲醇、70%甲醇與90%甲醇，最終選用提取率較高的70%甲醇。超聲提取時間在15 min、30 min與45 min 之間進行對比，結(jié)果表明選用超聲30 min的樣品，其提取率明顯高于15 min，與45 min的樣品相比差別不明顯。經(jīng)綜合考量，最終確定選用提取溶劑為70%甲醇，超聲提取時間選擇30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

流動相的優(yōu)化先采用相同比例的甲醇-水、甲醇-水（含0.1%甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1%甲酸）進行考察。結(jié)果顯示使用乙腈作為有機相時，其圖譜的峰型比甲醇的更好，目標(biāo)化合物的分離程度也更好；而對比加入0.1%的甲酸的水相與純水相，可明顯看到加入0.1%的甲酸可以有效增強這5種化合物的信號強度，也能改善峰形的對稱性。最后考察了不同梯度的洗脫方式，進一步提升了分離效率。最終選擇乙腈-水（含0.1%甲酸）作為流動相，采用梯度洗脫方式進行試驗。

10批樣品測定結(jié)果中可以看出，由于鹽酸小檗堿以原料藥細(xì)粉入藥，各批次含量結(jié)果差異最??；以黃芩苷作為黃芩浸膏原料的特征成分，各個批次含量結(jié)果差異也相對較??；以大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為大黃藥材細(xì)粉及浸膏原料的特征成分來看，呈現(xiàn)出較大差異。其中相同廠家不同批次之間差異較小，不同廠家之間各組分含量及相應(yīng)比例均有較為明顯的差異。