劉麗娟 趙亞 吳亞運 趙瑞芝 盧傳堅

中圖分類號 R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）16-1982-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.11

摘 要 目的：建立和膚止癢方的指紋圖譜并進行聚類分析，建立該方中8種成分的含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供參考。方法：采用超高效液相色譜法（UPLC）。以ACQUITY UPLC BEH C18為色譜柱，以乙腈-0.1%冰醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為236 nm，進樣量為5 μL。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》建立10批和膚止癢方的指紋圖譜，與對照品比對指認色譜峰，并進行相似度評價。使用SPSS 21.0軟件對10批樣品進行聚類分析。采用上述UPLC法測定10批樣品中沒食子酸等8種成分的含量。結(jié)果：從10批和膚止癢方的UPLC指紋圖譜中標定共有峰34個，指認出峰1為沒食子酸、峰10為阿魏酸、峰13為落新婦苷、峰23為丹皮酚、峰28為白鮮堿、峰31為黃柏酮、峰32為梣酮、峰34為蛇床子素，與對照指紋圖譜的相似度為0.923～0.979。10批樣品中，S1、S2、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類，S3、S4、S9聚為一類。上述8種成分的平均含量分別為0.596～0.714、0.262～0.321、7.647～9.859、0.113～0.644、0.170～0.202、0.854～1.281、0.631～0.857、3.243～3.548 mg/g。結(jié)論：成功建立了和膚止癢方的UPLC指紋圖譜和8種成分的含量測定方法。

關(guān)鍵詞 和膚止癢方;超高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定;聚類分析

Establishment of UPLC Fingerprint of Hefu Zhiyang Decoction and Content Determination of 8 Components

LIU Lijuan1，ZHAO Ya1，WU Yayun1，ZHAO Ruizhi1，LU Chuanjian2，3（1. Innovative Team for Modern Interpretation of TCM Property Theory， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China; 2. Dermatological Department， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510120， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Research on Traditional Chinese Medicine Syndrome，Guangzhou 510120，China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint and conduct cluster analysis of Hefu zhiyang decoction （HFZYD）， and establish the method for content determination of 8 components， so as to provide reference for the quality control of HFZYD. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on ACQUITY UPLC BEH C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% glacial acetic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature maintained at 30 ℃， and detection wavelength was 236 nm. The sample size was 5 μL. The fingerprint of 10 batches of HFZYD was established with Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）. Compared with substance control， the common peaks were identified. The similarity evaluation was conducted. SPSS 21.0 software was used to conduct cluster analysis of 10 batches of samples. The contents of 8 components such as gallic acid in 10 batches of samples were determined by above UPLC. RESULTS： There were 34 common peaks in the UPLC fingerprint of 10 batches of HFZYD， identified as peak 1 was gallic acid， peak 10 was ferulic acid， peak 13 was astilbin， peak 23 was paeonol， peak 28 was dictamnine， peak 31 was obacunone， peak 32 was fraxinellone， and peak 34 was osthole. Its similarity with the control fingerprint was 0.923-0.979. Among 10 batches of samples， S1， S2， S5， S6， S7， S8 and S10 were clustered into one category， and S3， S4 and S9 were clustered into one category. The average contents of above 8 components were 0.596-0.714， 0.262-0.321， 7.647-9.859， 0.113-0.644， 0.170-0.202， 0.854-1.281， 0.631-0.857， 3.243-3.548 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： UPLC fingerprint and the method for content determination of 8 components in HFZYD are established successfully.

KEYWORDS? ?Hefu zhiyang decoction; UPLC; Fingerprint; Content determination; Cluster analysis

銀屑病為炎癥性、免疫相關(guān)性、難治性、復(fù)雜性皮膚病，一旦發(fā)病需終生服藥，給患者及社會造成極大的經(jīng)濟負擔[1]。目前，根據(jù)疾病的不同表現(xiàn)，西醫(yī)常采用抗炎藥、抗增殖藥以及免疫抑制劑、生物制劑進行治療。常規(guī)用藥雖可短期控制患者癥狀，但長期應(yīng)用存在肝腎毒性、致畸等嚴重毒副作用[2];生物制劑雖療效確切、肝腎毒性小，但存在價格昂貴和易引發(fā)感染性疾病、腫瘤等問題[3]。因此，現(xiàn)有銀屑病的治療方法難以滿足臨床需求，亟需新的治療策略。

中醫(yī)學(xué)在治療銀屑病方面積累了豐富的經(jīng)驗。“岐黃學(xué)者”盧傳堅教授根據(jù)長期臨床實踐總結(jié)出治療銀屑病的驗方——和膚止癢方，由徐長卿、白鮮皮、蛇床子、土茯苓、熟地黃、當歸和石榴皮等（質(zhì)量比為3 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 3）7味中藥組成。該方通過藥浴治療銀屑病瘙癢癥數(shù)十年，療效確切且無明顯副作用，目前正處于新藥開發(fā)階段[4]。由于中藥成分復(fù)雜，所以保持質(zhì)量一致性成為其新藥開發(fā)中質(zhì)量控制的難點。中藥指紋圖譜可較全面地反映中藥及復(fù)方制劑中所包含的化學(xué)成分，是中藥質(zhì)量控制的有效手段之一[5-6]。基于此，本研究擬通過超高效液相色譜法（UPLC）建立和膚止癢方的指紋圖譜，并進行相似度評價和聚類分析，同時對指認的8種有效成分（沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮、蛇床子素）進行含量測定，從定性與定量兩個角度對和膚止癢方進行評價，以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACQUITY型UPLC儀及配備的四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、光電二極管陣列（PDA）檢測器、Empower 3軟件（美國Waters公司），BT125D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），Centrifuge 5418R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Rotavapor R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司），Milli-Q型純水機（美國Millipore公司），N-EVAP24型氮吹儀（美國Organomation公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號MB2707，純度≥98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;阿魏酸對照品（批號L03A9D55744，純度≥98%）、落新婦苷對照品（批號Y11O10H99801，純度≥98%）、丹皮酚對照品（批號L15D9D77791，純度≥98%）、白鮮堿對照品（批號P12J11S118162，純度≥98%）、黃柏酮對照品（批號Z11A8S33620，純度≥98%）、梣酮對照品（批號Z31A7S20284，純度≥98%）、蛇床子素對照品（批號T08M8B30733，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司;乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）均購自德國Merck公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

徐長卿、白鮮皮、蛇床子、土茯苓、熟地黃、當歸和石榴皮飲片分別由廣東省中醫(yī)院提供（含批號200605261、191003651、2005001、2008001、200403611、200501861、200800101、200601、200801、191202721、YPB0F001、191205271）或購自佛山百姓緣大藥房（含批號18Z0901、191001、18Z1201、20Z0601、20200601、20Z0501、20190901）、廣州養(yǎng)和醫(yī)藥股份有限公司（含批號181201、20010101、190901、190601、20040701、1901001、2001001）、廣州柏恩醫(yī)藥連鎖有限公司（含批號190501、20200401、190617、200501、200201、200101-9、190601）和廣州海王星辰健康藥房（含批號201806451、20200201、190501、20200501、20200601-1、200428、20170501），經(jīng)廣東省中醫(yī)院陳文良主管中藥師鑒定，分別為蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bge.）Kitag的干燥根及根莖（產(chǎn)地：河北、安徽、遼寧），蕓香科植物白鮮Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮（產(chǎn)地：山東、河北），傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cuss.的干燥成熟果實（產(chǎn)地：河北、江西、廣西、安徽），百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖（產(chǎn)地：廣西），玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根炮制加工品（產(chǎn)地：河南），傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根（產(chǎn)地：甘肅），石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮（產(chǎn)地：湖南、河南、廣西）;各飲片按處方比例隨機組合，得10批和膚止癢方樣品（編號S1～S10），詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以乙腈為流動相A、0.1%冰醋酸溶液為流動相B進行梯度洗脫（0～18.5 min，5%A→10%A;18.5～20 min，10%A→13%A;20～26 min，13%A→12%A;26～28 min，12%A→18%A;28～31 min，18%A→14%A;31～44 min，14%A→33%A;44～47 min，33%A→42%A;47～55 min，42%A→50%A）;流速為0.25 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為236 nm;進樣量為5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮、蛇床子素對照品適量，精密稱定，加入甲醇溶解并稀釋，混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.512、0.536、0.516、0.536、0.560、0.577、0.542、0.725 mg/mL的單一對照品貯備液。精密吸取上述單一對照品貯備液各適量，以甲醇稀釋制成每1 mL含沒食子酸40 μg、阿魏酸10 μg、落新婦苷360 μg、丹皮酚15 μg、白鮮堿6 μg、黃柏酮3 μg、梣酮35 μg、蛇床子素80 μg等8種成分的混合對照品溶液;同法配制每1 mL含白鮮堿6 μg、黃柏酮3 μg、梣酮35 μg等3種成分的混合對照品溶液和單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 按處方比例分別取徐長卿、白鮮皮、蛇床子、土茯苓、當歸、石榴皮的單味飲片粉末（過三號篩，下同），精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入10倍量水（mL/g）浸泡30 min，加熱回流提?。ㄒ晕浠鹬蠓校笥梦幕鹞⒎? h），趁熱過濾，剩余藥渣以同法煎煮后趁熱過濾，合并兩次濾液并濃縮，用水定容至50 mL，即得和膚止癢方樣品。同法制備單味藥材樣品和分別缺徐長卿、白鮮皮、蛇床子、土茯苓、當歸、石榴皮的陰性樣品。取上述樣品溶液200 μL，加入甲醇800 μL，混勻，于4 ℃下以14 000×g離心15 min，取上清液，于40 ℃水浴下以氮氣流吹干，殘渣加入流動相（乙腈與0.1%冰醋酸溶液體積比為1 ∶ 9，下同）1 000 μL復(fù)溶，混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得單味藥材樣品溶液、陰性樣品溶液、和膚止癢方供試品溶液。

2.3 和膚止癢方指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取和膚止癢方供試品溶液（編號S1），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。以落新婦苷峰（對應(yīng)色譜峰保留時間適中且峰面積相對較大）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不大于0.19%（n=6），相對峰面積的RSD均不大于2.75%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取和膚止癢方供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以落新婦苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不大于0.19%（n=7），相對峰面積的RSD均不大于2.98%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一編號和膚止癢方樣品（編號S1）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以落新婦苷峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均不大于0.45%（n=6），相對峰面積的RSD均不大于2.87%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立與色譜峰的指認 取10批和膚止癢方供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行圖譜數(shù)據(jù)分析，以S1為參照圖譜，將時間窗寬度設(shè)定為0.1 min，采用多點校正和全譜峰匹配生成疊加指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R）。結(jié)果，10批樣品的指紋圖譜中共標定共有峰34個，詳見圖1。通過與含8種成分的混合對照品溶液的色譜圖（同法測定，見圖2）進行比對，指認峰1為沒食子酸、峰10為阿魏酸、峰13為落新婦苷、峰23為丹皮酚、峰28為白鮮堿、峰31為黃柏酮、峰32為梣酮、峰34為蛇床子素。

2.3.5 相似度評價 以對照指紋圖譜為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對10批和膚止癢方的指紋圖譜進行相似度評價。結(jié)果，10批樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.975、0.979、0.938、0.961、0.978、0.979、0.972、0979、0.923、0.976，均大于0.90。

2.4 聚類分析

使用SPSS 21.0軟件，采用組間連接法，以平方歐氏距離為測量區(qū)間，對10批和膚止癢方樣品的34個共有峰的峰面積進行聚類分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當平方歐氏距離為20時，10批樣品可聚為兩類，其中S1、S2、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類，S3、S4、S9聚為一類。

2.5 和膚止癢方有效成分的含量測定

2.5.1 專屬性考察 取空白對照溶液（流動相）、單一對照品溶液和“2.2.2”項下的單味藥材樣品、陰性樣品、和膚止癢方供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮、蛇床子素、落新婦苷、阿魏酸和沒食子酸色譜峰的分離度均良好，且陰性樣品無干擾，詳見圖4。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下含8種成分的混合對照品溶液，用流動相逐級稀釋0、2、4、8、16、32倍，得6個質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（x，μg/mL）、相應(yīng)峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結(jié)果，沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮、蛇床子素等8種成分在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（R 2>0.999），詳見表2。

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下含8種成分的混合對照品溶液，用流動相稀釋4倍，再按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮和蛇床子素峰面積的RSD分別為0.21%、0.19%、0.36%、0.84%、0.45%、0.37%、0.44%和0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一和膚止癢方供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，供試品溶液中沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮和蛇床子素峰面積的RSD分別為1.03%、0.87%、0.32%、0.39%、1.07%、0.30%、0.90%和0.87%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗 取同一批和膚止癢方樣品（編號S1）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算含量。結(jié)果，供試品溶液中沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮和蛇床子素含量的RSD分別為2.45%、1.31%、1.43%、1.98%、1.90%、2.53%、2.65%和2.18%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含量的和膚止癢方樣品（編號S1），分別精密加入與樣品中各成分等量的單一對照品溶液（以甲醇為溶劑），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。每樣品平行操作6份。結(jié)果，供試品溶液中沒食子酸、阿魏酸、落新婦苷、丹皮酚、白鮮堿、黃柏酮、梣酮和蛇床子素的平均加樣回收率分別為102.33%、102.29%、100.83%、103.29%、99.53%、103.22%、100.86%和102.87%，RSD分別為1.80%、1.54%、1.75%、1.70%、0.86%、1.09%、2.13%和1.31%（n=6）。

2.5.7 樣品含量測定 取10批和膚止癢方，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并代入回歸方程計算8種成分的含量。每樣品平行操作3份，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 和膚止癢方方解

和膚止癢方中徐長卿和白鮮皮為君藥，蛇床子和土茯苓為臣藥，熟地黃和當歸為佐藥，石榴皮為使藥。其中，徐長卿善祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)，其性溫而不燥、祛邪而不傷正、滋補而不礙邪，白鮮皮利濕熱、兼祛風(fēng)，一溫一寒，辛溫能祛風(fēng)濕，苦寒能降濕熱，既可止癢又可扶正;蛇床子善止癢，能溫腎陽而祛風(fēng)濕，土茯苓入經(jīng)絡(luò)解濕毒，配合君藥可加強化濕解毒作用;熟地黃和當歸為“潤燥二味”，熟地黃色黑入腎水，滋腎陰，配以活血補血的當歸，陰血雙補且補中有通，佐以君臣藥發(fā)揮潤燥止癢之功;石榴皮取“以皮走皮”之意，引藥力走于皮膚;諸藥合用，共奏扶正和膚潤燥、健脾祛濕止癢之功。

3.2 和膚止癢方指紋圖譜及聚類分析

落新婦苷是臣藥土茯苓的主要有效成分，且落新婦苷色譜峰響應(yīng)值相對較高，出峰時間穩(wěn)定、適中，因此選擇其為參照。本研究建立了10批和膚止癢方的指紋圖譜，與對照指紋圖譜的相似度為0.923～0.979，說明10批樣品質(zhì)量穩(wěn)定。聚類分析結(jié)果顯示，10批樣品可聚為兩類，S1、S2、S5、S6、S7、S8、S10聚為一類，S3、S4、S9聚為一類。

3.3 定量指標的選擇

本研究通過與對照品色譜圖進行比對，指認了10批和膚止癢方中的8個共有峰，其中包括君藥徐長卿、白鮮皮的主要有效成分丹皮酚、梣酮、黃柏酮、白鮮堿，臣藥蛇床子、土茯苓的蛇床子素和落新婦苷，佐藥當歸的阿魏酸，使藥石榴皮的沒食子酸;上述成分大多為2020年版《中國藥典》（一部）中單味藥項下規(guī)定的指標性成分[7]。丹皮酚是徐長卿的主要活性成分，具有抗炎、抑制酪氨酸酶、保護神經(jīng)和抗病毒等作用，是徐長卿祛風(fēng)止癢的物質(zhì)基礎(chǔ)[8-9]。梣酮、黃柏酮、白鮮堿具有抗菌、抗炎、抗蟲、抗過敏、抗氧化等活性，是白鮮皮發(fā)揮清熱燥濕、祛風(fēng)解毒作用的活性成分[10]。另有報道指出，白鮮皮可引起藥物性肝損傷[11-12]，梣酮是其引起肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，且與細胞色素P4503A4酶相關(guān)[13-14]。因此，對和膚止癢方中白鮮皮的質(zhì)量進行控制至關(guān)重要。蛇床子素有抗炎、抗過敏、抗氧化以及類激素樣等作用，是蛇床子殺蟲止癢、燥濕祛風(fēng)的功效基礎(chǔ)[15-17]。落新婦苷具有抗炎、抗氧化和選擇性免疫抑制、神經(jīng)保護等基于清熱解毒功效的藥理作用[18]。阿魏酸有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、提高人體免疫功能、降低血液黏度等基于補血活血功效的藥理活性[19-20]。沒食子酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗真菌等多種藥理活性[21-23]?；诖耍狙芯窟x擇丹皮酚、梣酮、黃柏酮、白鮮堿、蛇床子素、落新婦苷、阿魏酸和沒食子酸作為和膚止癢方的質(zhì)量控制指標。

綜上所述，本研究成功建立了和膚止癢方的UPLC指紋圖譜和8種主要成分的含量測定方法，可用于該方的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2021-04-06 修回日期：2021-07-23）

（編輯：鄒麗娟）