魏君楠，戴建業(yè)

中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)鑒定研究方法及應(yīng)用

魏君楠，戴建業(yè)*

蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

中藥因其確切的臨床療效受到越來越多的關(guān)注。隨著對(duì)中藥活性成分的深入研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)很多具有獨(dú)特活性和藥效的潛在創(chuàng)新藥物。然而，如何進(jìn)一步對(duì)其藥效機(jī)制進(jìn)行挖掘、發(fā)現(xiàn)全新的機(jī)制和靶點(diǎn)，成為創(chuàng)新中藥研究的關(guān)鍵。中藥活性成分靶點(diǎn)鑒定一直是研究者們所探尋的重要課題。隨著化學(xué)生物學(xué)技術(shù)尤其是化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的方法被建立并用于中藥活性成分的靶點(diǎn)鑒定。簡(jiǎn)單來說，這些方法大致可被分為標(biāo)記法和非標(biāo)記法。標(biāo)記法是通過將中藥活性成分改造為活性探針，進(jìn)而探尋它們的作用靶標(biāo)蛋白；而非標(biāo)記法主要是基于中藥活性成分和靶標(biāo)蛋白結(jié)合后會(huì)影響靶標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性等生物物理性質(zhì)從而識(shí)別可能的作用靶點(diǎn)。主要針對(duì)這2大類靶點(diǎn)鑒定方法進(jìn)行歸納整理，從方法原理、大致操作流程、應(yīng)用、優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行闡述，為中藥活性成分靶點(diǎn)鑒定提供一定的參考，以期助力中藥創(chuàng)新研究。

中藥活性成分；靶點(diǎn)鑒定；標(biāo)記法；非標(biāo)記法；活性探針

藥物的原始創(chuàng)新研究一直備受關(guān)注。中藥作為經(jīng)過長(zhǎng)期臨床驗(yàn)證的具有完整理論體系的中華文化瑰寶，應(yīng)該成為藥物原始創(chuàng)新研究的寶庫(kù)。如何將現(xiàn)有臨床用藥經(jīng)驗(yàn)以及理論轉(zhuǎn)化為藥物創(chuàng)新的動(dòng)力，成為中醫(yī)藥研究者必須面對(duì)的問題。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，而中藥活性成分是中藥中具有醫(yī)療效用或生理活性的單體化合物，是新藥研發(fā)的重要來源。靶點(diǎn)是中藥活性成分發(fā)揮作用的基礎(chǔ)[1]。中藥活性成分通過靶向作用于體內(nèi)的生物大分子，調(diào)節(jié)其生物活性，進(jìn)而調(diào)控靶點(diǎn)分子下游的細(xì)胞信號(hào)通路，擾動(dòng)疾病網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)防和治療疾病[2]，因此明確中藥活性成分作用靶點(diǎn)是中藥研發(fā)的關(guān)鍵。中藥具有廣泛的適應(yīng)癥，若可以精確關(guān)聯(lián)中藥活性成分及其適應(yīng)癥，再對(duì)中藥活性成分進(jìn)行深入的機(jī)制研究及靶點(diǎn)注釋，將“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”串聯(lián)起來，將有望突破現(xiàn)有知識(shí)體系的限制，發(fā)現(xiàn)全新機(jī)制和靶點(diǎn)，推動(dòng)原始創(chuàng)新藥物研究，為疾病治療提供新策略。

原始創(chuàng)新藥物研究的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)全新的機(jī)制和靶點(diǎn)，而對(duì)具有已知藥效的中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)進(jìn)行鑒定將具有事半功倍的效果。一直以來，中藥及其活性成分的靶點(diǎn)鑒定是學(xué)者們持續(xù)關(guān)注且致力探索的領(lǐng)域，但鑒于未知小分子-蛋白相互研究方法的缺失，中藥活性成分靶點(diǎn)鑒定面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。隨著化學(xué)生物學(xué)、生物物理學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，藥物靶標(biāo)識(shí)別和機(jī)制的闡明取得了重大進(jìn)展，對(duì)揭示中藥藥效機(jī)制以及與全新靶點(diǎn)的理性設(shè)計(jì)至關(guān)重要[3]。目前中藥活性成分靶點(diǎn)主要是蛋白靶點(diǎn)，活性成分蛋白靶點(diǎn)鑒定的方法可分為標(biāo)記法和非標(biāo)記法。本文將從這2個(gè)方面展開解析，為中藥活性分子靶點(diǎn)鑒定的研究提供借鑒。

1 基于標(biāo)記法對(duì)活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行鑒定

標(biāo)記法是通過化學(xué)改造，將中藥活性成分改造成具有標(biāo)記能力的探針，進(jìn)而通過熒光成像或富集技術(shù)，對(duì)其作用靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行鑒定。最傳統(tǒng)的方法是親和色譜-蛋白質(zhì)譜學(xué)聯(lián)用法，其大致流程為對(duì)活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，引入生物素與細(xì)胞裂解液共孵育，當(dāng)藥物與其靶標(biāo)蛋白形成穩(wěn)定結(jié)合后，利用一定固載方式（如瓊脂糖珠等）進(jìn)行富集，最后通過變性或競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)將結(jié)合蛋白洗脫下來進(jìn)行鑒定。對(duì)于親和色譜法來說，主要存在2個(gè)缺陷：第1個(gè)是需要區(qū)分真正的高親和力靶標(biāo)蛋白質(zhì)與低親和力但豐度高的蛋白質(zhì)；第2個(gè)是洗脫過程依賴經(jīng)驗(yàn)，洗滌條件過強(qiáng)會(huì)大大減少鑒定到的靶點(diǎn)數(shù)，而洗脫條件過弱則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)瓊脂糖珠上的非特異性吸附也會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果[4]。由此，化學(xué)和生物學(xué)家們一直在發(fā)展同時(shí)適用于低豐度或者結(jié)合力相對(duì)弱的靶點(diǎn)鑒定方法，其中最突出、實(shí)用的是基于活性的蛋白質(zhì)分析（activity-based protein profiling，ABPP）[5]。ABPP由美國(guó)Scripps研究所Cravatt課題組首次提出，該方法的核心是設(shè)計(jì)1個(gè)可以在蛋白質(zhì)組水平上與蛋白活性中心共價(jià)或非共價(jià)反應(yīng)的“活性分子探針（activity-based probe，ABP）”。

ABP主要包括2部分：第1部分是反應(yīng)基團(tuán)即活性基團(tuán)，反應(yīng)基團(tuán)是活性分子探針的核心，決定了在蛋白質(zhì)組學(xué)中與其反應(yīng)的蛋白種類以及氨基酸殘基，對(duì)于某些反應(yīng)基團(tuán)可以選擇性地與蛋白質(zhì)組中某一類蛋白酶的活性中心結(jié)合，并與其中執(zhí)行重要功能的親核氨基酸發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，將探針與靶標(biāo)蛋白牢牢地結(jié)合在一起[6]；但對(duì)于無(wú)法和靶標(biāo)蛋白共價(jià)結(jié)合的探針，就需要引入光交聯(lián)基團(tuán)將非共價(jià)作用轉(zhuǎn)化為共價(jià)作用，這種技術(shù)稱為光親和力標(biāo)記（photoaffinity Labeling，PAL）[7]。PAL基本思路是在化合物中引入光交聯(lián)基團(tuán)[8]，常用的光交聯(lián)基團(tuán)包括二苯甲酮、芳香疊氮、雙吖丙啶[9]。通過PAL技術(shù)可以幫助標(biāo)記細(xì)胞或者細(xì)胞裂解液中低豐度或與探針親和力較弱的靶標(biāo)蛋白，也可以標(biāo)記膜上受體等通常方法不易鑒定的蛋白質(zhì)[10]。第2部分是報(bào)告基團(tuán)，報(bào)告基團(tuán)主要包括羅丹明、熒光素等熒光基團(tuán)以及生物素。羅丹明等熒光基團(tuán)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的可視化、高通量檢測(cè)；生物素可以通過與鏈霉親和素（streptavidin，SA）反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的富集，然后進(jìn)行生物質(zhì)譜分析。此外，將ABPP與細(xì)胞培養(yǎng)中氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記、同位素二甲基化標(biāo)記等技術(shù)聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間的直接蛋白定量[11]。

在基于標(biāo)記法對(duì)活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行鑒定的過程中最重要的是對(duì)活性成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，化合物活性探針的構(gòu)建主要包括通過引入生物素標(biāo)簽構(gòu)建活性成分探針、通過引入炔基或疊氮構(gòu)建活性成分探針以及針對(duì)活性氨基酸殘基的分子探針。

1.1 通過引入生物素標(biāo)簽構(gòu)建活性成分探針

該方法的大致思路是通過對(duì)活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，引入生物素分子標(biāo)簽作為報(bào)告基團(tuán)構(gòu)建靶標(biāo)-化合物-標(biāo)簽，用SA進(jìn)行富集從而實(shí)現(xiàn)活性成分靶標(biāo)的富集以及鑒定。生物素廣泛存在于動(dòng)植物的組織中，生物素分子主要由2部分組成：一部分是與親和素結(jié)合的咪唑酮環(huán)，另一部分是噻吩環(huán)，噻吩環(huán)的C-2位上連有戊酸側(cè)鏈，可以通過對(duì)戊酸側(cè)鏈的改造從而將其引入到活性成分中。親和素是從卵白蛋白中提取的一種由4個(gè)相同亞基組成的堿性糖蛋白，生物素和親和素之間存在天然的特異性強(qiáng)相互作用，此外1個(gè)生物素可以與4個(gè)親和素結(jié)合，這一特點(diǎn)可以用于構(gòu)建1個(gè)多層次信號(hào)放大系統(tǒng)[12]。但由于親和素帶有1個(gè)糖鏈側(cè)鏈，容易和細(xì)胞表面的多糖發(fā)生非特異性親和，因此又開發(fā)出SA，SA由完全相同的4條肽鏈組成，1個(gè)生物素仍然可以和4個(gè)SA結(jié)合，但是其沒有糖基側(cè)鏈，從而避免了與膜表面的多糖發(fā)生特異性結(jié)合[13]。該法極大地減少了后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作步驟，還可以通過改變小分子與生物素之間的連接基團(tuán)，有效地調(diào)整探針的脂溶性以及水溶性。

Zhu等[14]報(bào)道了雷公藤紅素可以通過抑制抵抗性炎癥改善高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征，其通過對(duì)雷公藤紅素結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾在其羧基端引入生物素，構(gòu)建Cel-biotin分子探針，之后和標(biāo)記的核糖核酸親和純化（tagged RNA affinity purification，TRAP）技術(shù)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以與腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1（cyclase associated protein 1，CAP1）結(jié)合，抑制CAP1與抵抗素的相互作用，從而抑制環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）-核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠代謝綜合征。Zhao等[15]合成了生物素化的雷公藤甲素和熒光菁標(biāo)記的雷公藤甲素，以富集和可視化雷公藤甲素靶標(biāo)蛋白，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以靶向過氧化物酶I（peroxredoxin I，Prx I）。Prx I是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)，既作為抗氧化酶又作為分子伴侶，在腫瘤和炎癥發(fā)展中起著重要作用。雷公藤甲素可以與在維持Prx I的十聚體結(jié)構(gòu)和伴侶活性中起關(guān)鍵作用的83和173位半胱氨酸特異性地結(jié)合，觸發(fā)Prx I的高相對(duì)分子質(zhì)量低聚物的解離，從而以劑量相關(guān)性的方式抑制其伴侶活性，但不抑制其過氧化物酶活性。Dong等[16]在ainsliadimer A羥基位引入生物素進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的釣取，ainsliadimer A含有α,β-不飽和烯酮，可以與靶標(biāo)蛋白中的半胱氨酸殘基上巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)小分子和靶標(biāo)蛋白的共價(jià)結(jié)合；通過生物素-ainsliadimer A探針富集到了IκB激酶抑制劑α/β（inhibitor of IκB kinase α/β，IKKα/β）蛋白，ainsliadimer A可以選擇性地與IKKα/β 46位半胱氨酸殘基結(jié)合，通過變構(gòu)效應(yīng)抑制它們的活性，從而抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡并抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)以及內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。Liu等[17]對(duì)腺花香茶菜中的活性二萜化合物腺花素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，在其活性羥基端引入了生物素構(gòu)建腺花素探針，利用此探針釣取到靶標(biāo)蛋白過氧化物酶（Prx I和Prx II），腺花素通過靶向Prx I和Prx II的半胱氨酸，抑制該過氧化物酶活性提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平，激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，上調(diào)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β轉(zhuǎn)錄水平，從而誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的分化并抑制腫瘤生長(zhǎng)。Statsuk等[18]對(duì)海洋天然產(chǎn)物bistramide A進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾引入生物素，通過SA基質(zhì)進(jìn)行靶點(diǎn)富集，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白（actin）是bistramide A的細(xì)胞受體，可以直接與單體G-actin以1∶1比例結(jié)合從而破壞actin的細(xì)胞骨架，抑制actin聚合，在體外解聚合絲狀F-actin，從而抑制細(xì)胞增殖。

1.2 通過引入炔基或疊氮構(gòu)建活性成分探針

通過對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾引入長(zhǎng)鏈生物素來進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的富集，其缺點(diǎn)在于生物素相對(duì)分子質(zhì)量較大，會(huì)在一定程度上影響化合物的脂溶性使其不易進(jìn)入細(xì)胞，此外也會(huì)因空間位阻較大影響化合物與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合。為了減小生物素等報(bào)告基團(tuán)對(duì)化合物的影響實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l件下的標(biāo)記，點(diǎn)擊化學(xué)-ABPP（click chemistry-ABPP，CC-ABPP）應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)的原理為在盡可能小地改變化合物生理活性的前提下引入相對(duì)分子質(zhì)量較小的炔基或者疊氮，利用銅催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAc）或者環(huán)張力誘導(dǎo)的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)（strain promoted azide-alkyne cycloaddition，SPACC）等生物正交反應(yīng)，將生物素、熒光素等其他報(bào)告基團(tuán)連接在探針上實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物靶標(biāo)蛋白的富集以及可視化，這種方式使得探針能夠更好地模擬小分子在細(xì)胞內(nèi)的作用模式[19]。

Wang等[20]在青蒿素上連接1個(gè)炔基，合成了1個(gè)與青蒿素有相同活性和結(jié)合位點(diǎn)的探針，用以檢測(cè)青蒿素在治療瘧疾過程中的靶標(biāo)蛋白和具體作用機(jī)制，共尋找到124個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，涉及瘧原蟲體內(nèi)的各種通路；發(fā)現(xiàn)激活青蒿素的鐵離子來源于血紅素結(jié)合鐵而非游離鐵離子，青蒿素主要作用于瘧原蟲生命活動(dòng)的后期而非初期。此外，合成了1個(gè)具有炔基的姜黃素探針，采用點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合同位素標(biāo)記相對(duì)的絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)解析了姜黃素抗結(jié)腸癌的靶標(biāo)蛋白，從人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中確定了197個(gè)蛋白作為姜黃素結(jié)合靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)廣泛分布于細(xì)胞核、線粒體和質(zhì)膜中，參與代謝過程、調(diào)控、刺激反應(yīng)和細(xì)胞過程等多種生物學(xué)功能，提示姜黃素通過作用于真核翻譯起始因子2（eukaryotic translation initiation factor 2，EIF2）、EIF4/p70核糖體蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路和線粒體功能障礙通路等多個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)通路發(fā)揮抗癌作用，進(jìn)一步驗(yàn)證表明姜黃素可以通過下調(diào)細(xì)胞蛋白合成，誘導(dǎo)自噬、激活溶酶體和增加活性氧產(chǎn)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。Dai等[22]針對(duì)黃芩中的主要成分黃芩苷改善飲食誘導(dǎo)的肥胖（diet-induced obese，DIO）和肝脂肪變性的靶標(biāo)蛋白開展了深入研究，通過對(duì)黃芩苷的結(jié)構(gòu)修飾引入了二苯甲酮作為光交聯(lián)基團(tuán)，以炔基為手臂構(gòu)建了黃芩苷探針，利用此探針確定了脂肪酸氧化控制酶肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）為黃芩苷的關(guān)鍵靶點(diǎn)，黃芩苷選擇性直接激活肝臟CPT1，加速脂質(zhì)流入線粒體進(jìn)行氧化，從而改善DIO和肝脂肪變性。衣康酸是一種參與病原體巨噬細(xì)胞相互作用的抗炎代謝物，Qin等[23]開發(fā)了一種特異性的生物正交探針衣康酸酯炔，用于炎性巨噬細(xì)胞中衣康酸結(jié)合的定量和位點(diǎn)特異性化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在炎性巨噬細(xì)胞中鑒定了1926個(gè)衣康酸蛋白靶點(diǎn)，包括199個(gè)超敏蛋白靶點(diǎn)；此外，位點(diǎn)特異性分析發(fā)現(xiàn)了1131個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，包括參與炎性反應(yīng)和宿主防御的關(guān)鍵蛋白。Zhao等[24]將炔基引入到鶴草酚中，與疊氮生物素發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)并被SA捕獲，找到了鶴草酚殺死結(jié)核分枝桿菌作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)Rv3852；Rv3852是一個(gè)可預(yù)測(cè)的、體外結(jié)合DNA的膜蛋白，等溫滴定量熱法證實(shí)鶴草酚與Rv3852之間存在配體-蛋白相互作用，導(dǎo)致Rv3852的DNA結(jié)合功能被破壞從而殺死結(jié)核分枝桿菌。

1.3 針對(duì)活性氨基酸殘基的分子探針

由于要參與催化反應(yīng)，蛋白酶活性中心的氨基酸殘基通常是內(nèi)在化學(xué)性質(zhì)較為活潑的氨基酸[6]，針對(duì)不同的氨基酸殘基相繼開發(fā)出具有專一性的小分子探針，此外探針中不同類別的活性碳親電體在蛋白質(zhì)組中也顯示出迥然不同的氨基酸偏好。Weerapana等[25]合成了一些帶有不同親電基團(tuán)的分子探針，不同種類的碳親電試劑在蛋白質(zhì)組中表現(xiàn)出明顯不同的氨基酸標(biāo)記譜。2-氯--(6,5-炔基)乙酰胺和1-辛烯-7-炔-3-酮探針的反應(yīng)性非常有限，它們選擇性地標(biāo)記蛋白質(zhì)組中的半胱氨酸殘基，2-氯--(6,5-炔基)乙酰胺可以和半胱氨酸上的巰基發(fā)生親核取代；1-辛烯-7-炔-3-酮含有α,β不飽和酮，可以和巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。相比之下，十一碳- 10-炔-1-醇-苯磺酸鹽探針對(duì)天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和組氨酸殘基等氨基酸進(jìn)行了獨(dú)特的標(biāo)記。

由于巰基的高親核性和氧化還原活性，蛋白質(zhì)上的半胱氨酸殘基具有多種催化和調(diào)節(jié)功能，定量研究半胱氨酸反應(yīng)性的蛋白質(zhì)組學(xué)可以為復(fù)雜蛋白質(zhì)組中功能半胱氨酸殘基的翻譯后修飾狀態(tài)提供有價(jià)值的信息。碘乙酰胺-炔是ABPP研究中應(yīng)用最廣泛的硫醇反應(yīng)探針，該探針可以和半胱氨酸殘基上的巰基共價(jià)結(jié)合，利用該探針可以對(duì)蛋白質(zhì)組中的反應(yīng)型半胱氨酸進(jìn)行鑒定。Weerapana等[26]利用碘乙酰胺探針描述了一種基于同位素標(biāo)記的小分子親電試劑的定量反應(yīng)譜，來全面表征蛋白質(zhì)組中的半胱氨酸功能和活性。利用此探針在活細(xì)胞中標(biāo)記到了大量高反應(yīng)活性的半胱氨酸，在檢測(cè)到的890個(gè)人類蛋白中共標(biāo)記了8910個(gè)半胱氨酸中的1082個(gè)，在蛋白質(zhì)組中這些高反應(yīng)活性的半胱氨酸對(duì)其蛋白發(fā)揮重要的催化和/或調(diào)節(jié)功能。Abo等[27]對(duì)碘乙酰胺探針進(jìn)一步優(yōu)化合成了一種籠狀溴甲基酮親電試劑caged-BK探針，該探針通過紫外光照控制親電試劑的活化，利用該探針監(jiān)測(cè)了人表皮癌A431細(xì)胞在表皮生長(zhǎng)因子刺激下細(xì)胞活性氧釋放時(shí)半胱氨酸的反應(yīng)性變化，為識(shí)別不同半胱氨酸修飾相關(guān)反應(yīng)性變化研究提供了一個(gè)的強(qiáng)大工具。Qin等[28]報(bào)道了用于代謝聚糖標(biāo)記的過氧乙?；翘烊粏翁侨缢孽；?疊氮乙酰甘露糖胺，可以與各種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上的半胱氨酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，為開發(fā)基于半胱氨酸糖基化的半胱氨酸分析策略提供了機(jī)會(huì)。

絲氨酸水解酶是在真核生物和原核生物中發(fā)現(xiàn)的最大和最多樣化的一類酶，絲氨酸水解酶占哺乳動(dòng)物中所有蛋白質(zhì)的1%，在凝血、消化、神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥和癌癥等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。此外，絲氨酸水解酶在細(xì)菌和病毒中也發(fā)揮著重要作用[29]。Liu等[5]設(shè)計(jì)了1個(gè)帶有氟磷酸反應(yīng)基團(tuán)的分子探針，氟磷酸可以和絲氨酸水解酶活性中心的絲氨酸殘基羥基發(fā)生親核取代。-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯是絲氨酸水解酶抑制劑，其中氨基甲酸酯作為反應(yīng)基團(tuán)可以與絲氨酸水解酶中心的絲氨酸殘基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，它依賴于活性位點(diǎn)絲氨酸殘基羥基的強(qiáng)親核性。Niphakis等[30]合成了一系列氨基甲酸酯的衍生物探針來探究其在蛋白質(zhì)組中的反應(yīng)活性以及選擇性，發(fā)現(xiàn)它們都可以選擇性地與小鼠體內(nèi)不同的絲氨酸水解酶活性中心的絲氨酸殘基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。Gu等[31]研究了基于磺酰氟化物的化學(xué)探針在植物和動(dòng)物蛋白質(zhì)組上的標(biāo)記，該探針可以標(biāo)記絲氨酸蛋白酶活性中心絲氨酸以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶中的酪氨酸殘基。

賴氨酸殘基側(cè)鏈含有氨基具有親核性，且賴氨酸存在于許多功能位點(diǎn)如酶活性位點(diǎn)和介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)，因此賴氨酸是蛋白質(zhì)氨基酸中共價(jià)配體開發(fā)的潛在候選物。賴氨酸也經(jīng)常作為乙?；?、甲基化、泛素化等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的翻譯后調(diào)控位點(diǎn)。Shannon等[32]探索了一組通過親核芳香取代機(jī)制發(fā)揮作用的芳基鹵化物的蛋白質(zhì)反應(yīng)性，這些親電試劑的反應(yīng)活性可以通過改變芳基環(huán)上的取代基來微調(diào)，鄰氯硝基苯具有高度的半胱氨酸選擇性，而二氯三嗪有利于與賴氨酸的反應(yīng)。蛋白激酶在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著核心作用，所有的蛋白激酶的活性中心都含有1個(gè)保守的親核性賴氨酸位點(diǎn)，這類酶催化磷酸從三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）轉(zhuǎn)移并共價(jià)結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中某些絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性[33]。Patricelli等[34]合成了1個(gè)磷酸酰基探針，該探針可以和蛋白激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行選擇性共價(jià)反應(yīng)，從標(biāo)記的蛋白質(zhì)組中捕獲生物素化肽片段，然后使用基于質(zhì)譜的分析平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和鑒定。

除了上述針對(duì)半胱氨酸、絲氨酸、賴氨酸的特異性分子探針，對(duì)于其他活潑的氨基酸殘基也相繼開發(fā)出了一些探針。Hahm等[35]對(duì)磺酰氟化物探針進(jìn)行改進(jìn)，將離去基團(tuán)氟改為三氮唑使該探針對(duì)酪氨酸的選擇性提高至其他親核氨基酸的5倍。Bach等[36]使用光活化的2,5-二取代四唑，以優(yōu)異的選擇性定量細(xì)菌蛋白質(zhì)組中8971個(gè)天冬氨酸和谷氨酸。Ma等[37]描述了一種新的反應(yīng)性探針3-苯基-2-氮丙啶，它能夠在體外和原位條件下高效地對(duì)蛋白質(zhì)中的羧基進(jìn)行化學(xué)選擇性修飾，即可用于標(biāo)記天冬氨酸和谷氨酸。Lin等[38]以氧氮環(huán)丙烷為反應(yīng)基團(tuán)在一系列生物相容性的反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)高度選擇性、快速和穩(wěn)定的蛋氨酸標(biāo)記，從而識(shí)別整個(gè)蛋白質(zhì)組中高反應(yīng)活性的蛋氨酸殘基。

2 基于非標(biāo)記法對(duì)活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行鑒定

非標(biāo)記法是基于中藥活性成分和靶標(biāo)蛋白結(jié)合后會(huì)影響靶標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性、氧化速率等生物物理性質(zhì)，進(jìn)而識(shí)別中藥活性成分可能作用靶點(diǎn)。相較于標(biāo)記法，非標(biāo)記法不需要對(duì)活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。非標(biāo)記法主要包括藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）分析、氧化速率蛋白穩(wěn)定性（stability of proteins from rates of oxidation，SPROX）分析、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和熱蛋白組分析（thermal proteome profiling，TPP）。

2.1 DARTS

Lomenick于2009年首次提出DARTS技術(shù)，其主要利用藥物結(jié)合時(shí)靶標(biāo)蛋白對(duì)蛋白酶降解的敏感性降低這一特性，不需要對(duì)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾且不依賴藥物的活性，依賴于藥物分子和其蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間的親和性，因此能夠精確地找到藥物的直接結(jié)合靶點(diǎn)。Lomenick等[39]進(jìn)一步驗(yàn)證了DARTS技術(shù)的可行性，以免疫抑制藥物雷帕霉素和FK506的靶點(diǎn)FKBP12作為研究對(duì)象，枯草桿菌蛋白酶作為工具酶，觀察FKBP12與藥物結(jié)合后的抗水解作用，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白和藥物結(jié)合后靶標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性增強(qiáng)。DARTS技術(shù)的大致流程是細(xì)胞裂解、蛋白定量、加入小分子藥物與裂解液共同孵育、蛋白酶水解，最后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、蛋白二維電泳（2D-PAGE）、膠染色技術(shù)、凝膠或非凝膠質(zhì)譜技術(shù)、親核色譜等多種方法對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測(cè)或鑒定。

Kim等[40]采用DARTS技術(shù)驗(yàn)證了姜黃素與APN的相互作用，鏈霉蛋白酶處理2 min后APN的穩(wěn)定性明顯降低，而姜黃素處理過的APN穩(wěn)定性保持不變；還發(fā)現(xiàn)老刺木精可以直接作用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2，從而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Hwang等[41]報(bào)道了抗抑郁藥物舍曲林是自噬誘導(dǎo)劑，采用DARTS技術(shù)研究了電壓依賴性陰離子通道蛋白1（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1）與舍曲林的直接相互作用，發(fā)現(xiàn)舍曲林處理后，VDAC1對(duì)鏈霉蛋白酶的穩(wěn)定性增加，且成劑量相關(guān)性；而ACTB與舍曲林無(wú)結(jié)合親和力，其蛋白水解敏感性無(wú)變化。表明舍曲林特異性地結(jié)合到VDAC1，通過結(jié)合并拮抗線粒體VDAC1，導(dǎo)致細(xì)胞ATP降低，激活A(yù)MPK并抑制其下游mTOR-RPS6KB1信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。Huang等[42]通過DARTS、等溫滴定量熱法等技術(shù)發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛蘇林堿可以直接靶向熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）并破壞其與β-catenin的相互作用，從而增加泛素介導(dǎo)的β-catenin蛋白酶體降解。Huang等[43]以ES2和AtEXO70A1為例展示了如何通過DATRS技術(shù)來測(cè)試小分子與純化候選靶標(biāo)蛋白的相互作用。木香烴內(nèi)酯是一種天然倍半萜內(nèi)酯，具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性。Liu等[44]利用scPDB蛋白結(jié)構(gòu)庫(kù)進(jìn)行高通量反向虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)周期蛋白依賴性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）是木香烴內(nèi)酯最特異的結(jié)合蛋白；進(jìn)一步通過CETSA和DARTS技術(shù)證實(shí)了木香烴內(nèi)酯與CDK2可以結(jié)合，木香烴內(nèi)酯通過直接靶向CDK2，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。但DARTS技術(shù)的限制因素為質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，對(duì)于許多低豐度的靶標(biāo)蛋白來說不易將目標(biāo)蛋白可視化，此外進(jìn)化選擇上有些蛋白很難被蛋白酶消化[39]。

2.2 SPROX

SPROX技術(shù)主要基于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)配體的熱力學(xué)穩(wěn)定性，即在化學(xué)變性劑（如鹽酸胍或尿素）濃度增加的情況下利用過氧化氫氧化蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸（氧化產(chǎn)物為甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜），用電噴霧或基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法測(cè)定特定氧化時(shí)間下甲硫氨酸的氧化程度與變性劑濃度的函數(shù)，未氧化產(chǎn)物、氧化產(chǎn)物變性劑關(guān)系曲線的交點(diǎn)為遷移中點(diǎn)，由于蛋白質(zhì)和其配體結(jié)合后蛋白穩(wěn)定性提高，與對(duì)照組相比，在相同濃度的氧化產(chǎn)物下需要更多的變性劑，從而導(dǎo)致遷移中點(diǎn)右移[45]。SPROX優(yōu)點(diǎn)在于不需要純化蛋白，且可以與串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）、細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）相結(jié)合，通過標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基來確定肽的相對(duì)含量，以此擴(kuò)大SPROX在全蛋白質(zhì)組上的覆蓋率[46-47]。

Geer Wallace等[48]將iTRAQ與SPROX技術(shù)聯(lián)用，對(duì)低氧培養(yǎng)條件下的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裂解液進(jìn)行了與manassantin A的相互作用分析，共鑒定出28個(gè)蛋白，為后期闡明manassantin A的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。格爾德霉素是一種天然產(chǎn)物，具有良好的抗癌活性。Hsp90是格爾德霉素已知的靶點(diǎn)，格爾德霉素可直接與Hsp90端ATP結(jié)合域結(jié)合，抑制Hsp90 ATP酶活性，文獻(xiàn)報(bào)道的解離常數(shù)（d）值從納摩爾到微摩爾差異較大，Xu等[49]利用SPROX技術(shù)測(cè)量格爾德霉素與人乳腺癌MCF-7細(xì)胞裂解液中未純化的Hsp90的結(jié)合親和力，證實(shí)d值取決于SPROX分析前格爾德霉素與裂解液平衡的時(shí)間。Liu等[50]利用SPROX技術(shù)分析了MCF-7細(xì)胞分別與BT-474細(xì)胞、MDA-MB-468細(xì)胞的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差別，證明熱力學(xué)穩(wěn)定性差異可以區(qū)分不同的乳腺癌亞型。SPROX技術(shù)的限制因素在于只能檢測(cè)含有甲硫氨酸的蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合，此外并不是所有的甲氨酸殘基都表現(xiàn)出不同的氧化速率，因此不能完全確證蛋白質(zhì)和配體相互作用[51]。

2.3 CETSA

Martinez Molina等[52]基于配體誘導(dǎo)的靶標(biāo)蛋白熱穩(wěn)定性改變?cè)黹_發(fā)出CETSA技術(shù)，隨著溫度的升高，蛋白熱穩(wěn)定性降低，而小分子和靶標(biāo)蛋白結(jié)合后會(huì)改變靶標(biāo)蛋白的熱穩(wěn)定性。該方法的大致流程為將多個(gè)等量的細(xì)胞裂解液或者組織勻漿液與小分子孵育，然后加熱至不同溫度進(jìn)行熱變性；冷卻后，將樣品離心，從沉淀蛋白中分離可溶性組分；通過Western blotting法對(duì)可溶性部分中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，或基于質(zhì)譜方法根據(jù)其熔解曲線分析可溶性蛋白的熱穩(wěn)定性，從而確證小分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合。傳統(tǒng)的熱位移分析技術(shù)只能使用純化的蛋白質(zhì)，而CETSA的樣本可以為細(xì)胞裂解液、完整細(xì)胞以及組織勻漿液等，極大地?cái)U(kuò)大了樣品檢測(cè)范圍，使檢測(cè)更方便快捷。

Nagasawa等[53]開發(fā)了一種將CETSA和基于2D-PAGE的蛋白質(zhì)組學(xué)分析相結(jié)合的改進(jìn)方法即2DE-CETSA，通過2DE-CETSA分析了一種靶標(biāo)未知的化合物NPD10084，該化合物對(duì)大腸癌細(xì)胞具有較好的體內(nèi)外抗增殖活性，并確定了丙酮酸激酶肌亞型2（pyruvate kinase M2，PKM2）作為候選靶標(biāo)蛋白。NPD10084可以通過阻斷PKM2和β-catenin或STAT3間的蛋白-蛋白相互作用，進(jìn)而抑制下游信號(hào)通路。BH3模擬物類抗腫瘤藥物是一類靶向B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族抗凋亡成員蛋白的新型抗腫瘤藥物，可以模仿唯BH3域蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族抗凋亡成員結(jié)合并使其釋放促凋亡因子。Guo等[54]使用CETSA技術(shù)評(píng)估了不同BH3模擬物（ABT-737、ABT-199、A-1210477）對(duì)Bcl-2和髓樣細(xì)胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）的靶標(biāo)結(jié)合能力，并驗(yàn)證了該方法可以提供與體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)一致的親和力排序和選擇性。Ishii等[55]利用CETSA技術(shù)成功監(jiān)測(cè)了腦和脾臟樣本中受體相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1）抑制劑與體內(nèi)RIPK1直接結(jié)合，證明CETSA可以作為動(dòng)物和臨床研究的有力工具。-GlcNAc糖基化修飾參與基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等多種細(xì)胞生命活動(dòng)，并與II型糖尿病、老年神經(jīng)退行性疾病、癌癥等多種疾病密切相關(guān)；-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶能夠特異地催化蛋白質(zhì)發(fā)生-GlcNAc糖基化修飾。Drake等[56]用CETSA技術(shù)檢測(cè)了-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶對(duì)Nod2和Nod1細(xì)胞穩(wěn)定性的影響，該技術(shù)也將成為研究翻譯后修飾的有力工具。CETSA技術(shù)的限制因素在于：①較大的蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)復(fù)合物更可能產(chǎn)生較弱或沒有配體誘導(dǎo)反應(yīng)，在這方面的局限性仍需充分證實(shí)；②加熱會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，可以通過減少加熱時(shí)間、選擇合適的加熱方式、增加對(duì)照實(shí)驗(yàn)來解決；③小分子的孵育時(shí)間會(huì)影響小分子識(shí)別靶標(biāo)蛋白，如果此化合物參與快速響應(yīng)信號(hào)通路，可能會(huì)影響靶標(biāo)蛋白翻譯后的狀態(tài)，進(jìn)而影響抗體對(duì)靶標(biāo)蛋白的檢測(cè)，可以使用基于質(zhì)譜方法來檢測(cè)靶標(biāo)蛋白；④檢測(cè)需要的藥物濃度較高，在發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)的過程中明顯通量不足，常被用作靶點(diǎn)的驗(yàn)證[57]。

2.4 TPP

TPP將CETSA技術(shù)和基于多重定量質(zhì)譜相結(jié)合，可以監(jiān)測(cè)藥物作用過程中整個(gè)蛋白組蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的變化，增加了在靶點(diǎn)和脫靶識(shí)別以及生物識(shí)別上的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)蛋白的高通量檢測(cè)。其大致操作流程為將細(xì)胞或裂解液在有無(wú)化合物條件下處理，然后將樣本平均分成10份，在10個(gè)溫度下分別加熱，用PBS溶液提取可溶部分，再用胰蛋白酶處理樣本并用TMT10進(jìn)行標(biāo)記，最后混合所有樣本進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析，得到的報(bào)告離子強(qiáng)度用于擬合曲線并計(jì)算每個(gè)蛋白質(zhì)的特定熔解溫度（m），從而找到穩(wěn)定性差異蛋白[58]。除了化合物之外，核酸、蛋白間的相互作用或翻譯后修飾都會(huì)影響靶標(biāo)蛋白熱穩(wěn)定性。這種方法不僅僅能夠檢測(cè)細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)-配體相互作用，還可以檢測(cè)不同狀態(tài)下細(xì)胞蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性。該方法適用于體外、原位和體內(nèi)檢測(cè)，已成功應(yīng)用于藥物靶點(diǎn)和脫靶識(shí)別、蛋白質(zhì)代謝物和蛋白質(zhì)相互作用的研究。因此，TPP提供了一種獨(dú)特的視角，在蛋白質(zhì)組水平上了解蛋白質(zhì)的狀態(tài)和相互作用，從而為研究基本的生物過程及其潛在機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[59]。

天然產(chǎn)物vioprolide A～D對(duì)人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的毒性，Kirsch等[60]利用TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)了人外周血白血病T細(xì)胞Jurkat中vioprolide A的靶標(biāo)蛋白核仁蛋白14（nucleolar protein 14，NOP14），該蛋白在核糖體生物發(fā)生中起重要作用；并通過一系列蛋白質(zhì)組學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了NOP14是vioprolide A的特異性靶標(biāo)。Lu等[61]發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀可與惡性瘧原蟲TCP-1環(huán)復(fù)合物或含有TCP-1的伴侶蛋白（TRiC/CCT）結(jié)合，通過TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)氯馬斯汀使8個(gè)惡性瘧原蟲TRiC亞基不穩(wěn)定；利用SPROX技術(shù)進(jìn)一步證明氯馬斯汀會(huì)改變瘧原蟲TRiC δ亞基的熱力學(xué)穩(wěn)定性。Conophylline是從山茱萸中提取的一種長(zhǎng)春花生物堿，Kakegawa等[62]通過TPP技術(shù)鑒定出谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）是conophylline的結(jié)合蛋白，conophylline通過靶向GPX4誘導(dǎo)脂質(zhì)活性氧積累和自噬。Reinhard等[63]擴(kuò)展了TPP使用方法實(shí)現(xiàn)對(duì)人類細(xì)胞中跨膜蛋白小分子相互作用的檢測(cè)，將人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562加熱至70 ℃，然后用SDS、NP-40、CHAPS、CHAPSO、DDM、β-辛基葡萄糖苷、Brij 35或Pluronic F127進(jìn)行提取，并通過PAGE分析，結(jié)果表明0.4% NP-40足以溶解許多膜蛋白，且在親和蛋白組學(xué)研究中不影響蛋白-藥物親和性的準(zhǔn)確測(cè)定。

3 總結(jié)與展望

基于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)闡明中藥藥效機(jī)制及其作用靶點(diǎn)，是貫徹“傳承精華，守正創(chuàng)新”的關(guān)鍵，也是實(shí)現(xiàn)我國(guó)原始藥物創(chuàng)新的重要途徑。因此，尋找中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的學(xué)者共同關(guān)心的主題，但鑒于技術(shù)瓶頸，相關(guān)研究推進(jìn)困難。化學(xué)生物學(xué)等技術(shù)的興起為中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)鑒定提供了方法。蛋白質(zhì)作為生物功能直接的執(zhí)行者，更是成為學(xué)者們關(guān)注的重要藥物靶點(diǎn)。因此，本文系統(tǒng)綜述了基于化學(xué)生物學(xué)技術(shù)尤其是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)鑒定方法，以期為研究者提供借鑒。

具體來說，根據(jù)是否使用探針標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分以及天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn)鑒定方法可以被分為標(biāo)記法及非標(biāo)記法2大類。標(biāo)記法的應(yīng)用門檻較高，不適用于改造后活性喪失、化學(xué)合成困難以及微量的活性成分研究。應(yīng)用活性氨基酸殘基探針進(jìn)行研究時(shí)，只能針對(duì)與氨基酸殘基具有共價(jià)結(jié)合能力的活性成分，同時(shí)結(jié)合工具探針使用。但標(biāo)記法也具備明顯的優(yōu)勢(shì)，可以直接標(biāo)記直接靶標(biāo)蛋白，并通過后續(xù)蛋白變性的方法排除間接靶標(biāo)蛋白，大大降低了靶點(diǎn)鑒定過程中的假陽(yáng)性結(jié)果。非標(biāo)記法的結(jié)果可信度不如標(biāo)記法，同時(shí)很難排除藥物結(jié)合蛋白所在復(fù)合體中其他蛋白的影響。但非標(biāo)記法可以對(duì)任意活性成分（包括微量活性成分）甚至多成分進(jìn)行靶點(diǎn)鑒定。因此，將標(biāo)記法與非標(biāo)記法的主流技術(shù)原理整合在圖1，學(xué)者們?cè)谶x擇靶點(diǎn)鑒定方法時(shí)，可以根據(jù)其優(yōu)缺點(diǎn)自主選擇。

圖1 中藥活性成分直接作用靶點(diǎn)鑒定的研究方法以及流程圖

雖然中藥活性成分靶點(diǎn)鑒定對(duì)于新藥研發(fā)以及闡明中藥藥效機(jī)制至關(guān)重要，但是更應(yīng)該在所鑒定的靶點(diǎn)中尋找與藥物表型關(guān)聯(lián)最大的靶點(diǎn)，并通過后續(xù)應(yīng)用生物物理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)所鑒定的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。在明確了活性成分的靶點(diǎn)以及藥效機(jī)制后，再通過對(duì)活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改善先導(dǎo)化合物的理化性質(zhì)、藥效學(xué)性質(zhì)、藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)以及安全性等，從而得到成藥性更高的先導(dǎo)化合物，可以極大地縮短新藥研發(fā)進(jìn)程。

在用標(biāo)記法鑒定中藥活性成分靶點(diǎn)時(shí)除了上述提到的還包括噬菌體展示等技術(shù)，此外Epoxy- activated Sepharose 6B beads、AffiGel、Toyopearl、AQUAFIRMUS、SG beads等親和基質(zhì)也可以用于某些化合物靶標(biāo)蛋白的鑒定[64]。非標(biāo)記法還包括降解標(biāo)簽、RNA干擾、CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)、Connectivity Map等基于基因組學(xué)以及生物信息學(xué)分析的方法[65]，通過多種方法結(jié)合實(shí)現(xiàn)化合物靶點(diǎn)鑒定。

綜上所述，現(xiàn)階段學(xué)者們已經(jīng)應(yīng)用標(biāo)記法及非標(biāo)記法對(duì)中藥活性成分和天然產(chǎn)物靶點(diǎn)鑒定進(jìn)行了一定的研究。但是任何靶點(diǎn)的鑒定都需要進(jìn)一步的活性相關(guān)性研究，從而確定所鑒定靶點(diǎn)對(duì)其藥效的關(guān)鍵性。隨著科技的發(fā)展，未來會(huì)建立越來越多用于鑒定化合物靶點(diǎn)的方法，這些方法將共同推進(jìn)對(duì)中藥以及其活性成分的研究，推動(dòng)原始創(chuàng)新藥物研究以及中醫(yī)藥研究的科學(xué)化進(jìn)程。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research method and application for identifying direct target of bioactive components from traditional Chinese medicine

WEI Jun-nan, DAI Jian-ye

College of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Chinese herbal medicine has been paid more and more attention because of its exact clinical efficacy. With the in-depth study of the bioactive components of Chinese herbal medicine, many potential innovative drugs with unique activity and efficacy have been discovered. However, how to further explore the pharmacodynamic mechanism and discover new mechanisms and targets has become the key to the original innovative research of Chinese herbal medicine. The target identification of bioactive components in Chinese herbal medicine has always been an important topic that researchers have been exploring. With the development of chemical biology technology, especially chemical proteomics technology, more and more methods have been established for the identification of bioactive components in Chinese herbal medicine. These methods mainly include labeling and non-labeling methods. The labeling method is to transform the bioactive components into active probes, and then explores their target proteins, while the non-labeling method is mainly based on the biophysical properties such as the thermal stability of target proteins which will be affected by the combination of bioactive components of Chinese herbal medicine and target proteins, so as to identify possible targets. In this paper, these two kinds of target identification methods are summarized and elaborated from the aspects of principle, general operation process, application, advantages and disadvantages, etc., which provide a certain reference for the target identification of bioactive components, and expect to help the original innovative research of Chinese herbal medicine.

active components of Chinese herbal medicine; target identification; labeling method; label-free method; active probes

R285.52

A

0253 - 2670(2021)17 - 5378 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.030

2021-08-06

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC17063005）；甘肅省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（20JR10RA586）；中央高?；緲I(yè)務(wù)項(xiàng)目（lzujbky-2021- kb40）；隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才項(xiàng)目

魏君楠（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)生物學(xué)。E-mail: weijn19@lzu.edu.cn

戴建業(yè)，沈陽(yáng)藥科大學(xué)72期藥物制劑專業(yè)校友，隴原青年創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幮гu(píng)價(jià)以及分子機(jī)制研究。E-mail: daijy@lzu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]