朱紅紅，侯小琪，張 淼，周 濤，馮 力，王戌梅, 2*

基于HPLC的大黃居群蒽醌類成分含量測定及品質評價研究

朱紅紅1,2，侯小琪3，張 淼4，周 濤1，馮 力1，王戌梅1, 2*

1. 西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061 2. 陜西省中醫(yī)藥管理局七藥資源及抗腫瘤重點實驗室，陜西 西安 710061 3. 貴陽藥用植物園，貴州 貴陽 5500022 4. 禮縣春天藥業(yè)有限責任公司，甘肅 隴南 742200

以采自11個省共27個居群的大黃et藥材的根為研究對象，測定其總蒽醌及5個游離蒽醌成分的含量，為大黃的道地性形成研究提供參考。采用賽分RP-C18液相色譜柱（Amethyst C18-H，250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-0.1% 磷酸水（85︰15）溶液為流動相，體積流量1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長為254 nm。利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）及聚類分析等方法對含量測定結果進行分析。所選取的大黃藥材均達到了《中國藥典》2020年版規(guī)定的總蒽醌及5個游離蒽醌的含量標準，根據(jù)蒽醌成分含量差異可將不同居群的大黃劃分為2大類，并與大黃傳統(tǒng)的道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)相吻合。蘆薈大黃素、大黃素及大黃酸的含量在2組之間具有顯著性差異，表現(xiàn)為道地產(chǎn)區(qū)的含量顯著高于非道地產(chǎn)區(qū)。不同產(chǎn)地的大黃蒽醌含量存在明顯差異，蒽醌含量可作為評價大黃的道地性指標。

大黃；蒽醌類；蘆薈大黃素；大黃素；大黃酸；品質評價；地理分布；指紋圖譜

中藥材品質評價的根本在于分析其化學成分含量并構建化學成分指紋圖譜，建立藥材質量與化學成分之間的相關性。中藥材大多來源于植物物種，物種的基本組成單位是居群，藥材的質量差異也就體現(xiàn)為不同居群的藥用植物所含化學成分的差異。道地藥材也即種內(nèi)的某些特異居群[1]。因此，對不同居群的藥材原植物的化學成分進行研究，有助于闡明不同產(chǎn)地藥材的品質差異，并為道地藥材的質量評價提供參考標準。

大黃是我國傳統(tǒng)的大宗藥材之一，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等功效[2]。大黃的基原植物為蓼科（Polygonaceae）大黃屬Linn. 植物掌葉大黃Linn.、唐古特大黃(Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf或藥用大黃Baill，以上植物的干燥根及根莖入藥即為中藥大黃。課題組前期基于大黃原植物的葉片分裂程度、地理分布格局和ISSR分子標記的研究結果表明，大黃原植物的3個種是不成立的，應當作為一個物種[3-6]?；赟SR分子標記、少數(shù)幾個核基因以及簡化基因組的研究結果進一步表明，大黃原植物遺傳變異的地理分布格局可劃分為東、西2大支，分別對應傳統(tǒng)的非道地產(chǎn)區(qū)和道地產(chǎn)區(qū)[7-10]。大黃含有蒽醌類、二蒽酮類、鞣質及多糖等多類藥效活性成分，其中的蒽醌類是研究最多的活性成分，具有廣泛的藥理作用。大黃中的蒽醌類主要分為游離型和結合型[11]，其中的游離型蒽醌如大黃酸、大黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗菌及調(diào)節(jié)腎功能等作用[12-13]；結合型蒽醌如大黃酸苷、大黃素甲醚苷具有抗腫瘤、解毒、消癰等作用[14-15]。大黃的質量控制一般以蒽醌類成分的含量為標準，如《中國藥典》2020年版將大黃中的總蒽醌及5個游離蒽醌的含量作為大黃質量控制的指標[2]。

大黃原植物在我國分布范圍較廣，主要分布于山西、寧夏、甘肅、青海、西藏、四川、重慶、云南、陜西、河南、湖北11?。ㄗ灾螀^(qū)或直轄市）。據(jù)歷代本草記載，四川、甘肅和青海所產(chǎn)大黃的品質多優(yōu)于其他分布區(qū)，為大黃的道地產(chǎn)區(qū)[16]。近年來涉及大黃質量分析的研究[17-20]多采用大黃的栽培品種，并沒有涉及廣泛分布的野生大黃，因此不足以揭示我國大黃資源的品質差異規(guī)律。本研究按照《中國藥典》2020年版規(guī)定的大黃總蒽醌及5個游離蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚）的含量測定方法，在大黃原植物分布區(qū)內(nèi)采集了27個自然居群進行蒽醌類含量測定，利用主成分分析（principal components analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）及正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）方法對測定的結果進行統(tǒng)計分析，以期找尋我國野生資源大黃主要藥效成分的地理分布規(guī)律，為大黃的優(yōu)質種源篩選及質量控制研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030C 3D型高效液相色譜儀（日本島津公司）、S1-M82型中藥材高速粉碎機（九陽股份有限公司）、AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、KH-250E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品蘆薈大黃素（批號110795-201007）、大黃酸（批號110757-200206）、大黃素（批號 110756-200110）、大黃酚（批號 110796-201118）、大黃素甲醚（批號110758-201013）購自中國食品藥品檢定研究院，質量分數(shù)均大于98%。

甲醇（色譜純和分析純）和磷酸（分析純）購自西安科洛化玻儀器有限公司，鹽酸（分析純）購自國藥集團化學試劑陜西有限公司，三氯甲烷（分析純）購自西安安保化工有限責任公司。

本研究所用大黃原植物的根及根莖材料于2017—2019年采集自11個?。ㄗ灾螀^(qū)或直轄市），經(jīng)西安交通大學藥學院王戌梅教授鑒定，均為中藥大黃正品基原植物掌葉大黃Linn.、唐古特大黃(Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf或藥用大黃Baill。陰干后粉碎，過四號篩（75目），備用。實驗材料信息詳見表1。

表1 所采集的大黃藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加入甲醇溶解，制得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的質量濃度均為16 μg/mL，大黃素甲醚的質量濃度為8 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 總蒽醌測定的供試品溶液制備 稱取過篩（四號篩）后的粉末約0.15 g置錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱重后加熱回流1 h，置冷，再次稱定質量，加甲醇補足損失的質量，搖勻后濾過。精密量取5 mL濾液置燒瓶中，蒸干溶劑，加10 mL 8%鹽酸溶液，超聲2 min后加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h后置分液漏斗中，分取三氯甲烷層。酸液用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解后轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.2.2 5個游離蒽醌測定的供試品溶液制備 稱取過篩（四號篩）后的藥材粉末約0.5 g置錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定質量后加熱回流1 h，置冷，再次稱重，用甲醇補足損失的質量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：賽分RP-C18液相色譜柱（Amethyst C18-H，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15）；檢測波長為254 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。以上色譜條件下的混合對照品和樣品（GSZQ）色譜圖見圖1。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取蘆薈大黃素對照品溶液2、5、10、20、30、50 μL，其余對照品溶液2、5、10、20、30 μL，按“2.3”項的色譜條件進樣，測定峰面積值，以峰面積積分值為縱坐標（），各成分質量濃度為橫坐標（），測得5個成分的回歸方程及線性范圍（表2），結果表明線性關系良好。

2.4.2 精密度考察 將甘肅舟曲的樣品（GSZQ）按照“2.2”項方法制得供試品溶液，按“2.3”項的色譜條件重復進樣6次，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為2.22%、2.43%、1.87%、1.22%、1.87%，表明儀器精密度良好。

1-蘆薈大黃素 2-大黃酸 3-大黃素 4-大黃酚 5-大黃素甲醚

表2 5個成分回歸方程及線性范圍

2.4.3 重復性考察 將GSZQ的樣品按照“2.2”項平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項的色譜條件進樣，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質量煩分數(shù)的RSD分別為1.10%、1.85%、1.40%、1.16%、2.12%，表明方法重復性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 將GSZQ的樣品按照“2.2”項制備供試品溶液，分別于制備后的0、4、8、12、24 h進樣，測量蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積積分值，計算RSD分別為2.24%、1.53%、2.76%、1.15%、2.89%，表明制得的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 將GSZQ的樣品按照“2.2”項制備6份供試品溶液，分別精密加入混合對照品溶液制得樣品，進樣分析，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5個成分的平均加樣回收率，依次為99.88%、99.75%、99.91%、99.77%、99.91%，RSD分別為0.74%、1.32%、0.82%、0.91%、1.01%。

2.5 樣品測定

分別取27個居群的大黃粉末，每份樣品按“2.2”項的處理方法重復制備3份供試品溶液，按“2.3”項的色譜條件進樣，記錄對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰面積，按照外標法分別計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，其中總蒽醌成分的含量按“2.2”項下方法處理后得到的5個游離蒽醌成分的總量計。不同居群的大黃總蒽醌和5個游離蒽醌成分的含量測定結果見圖2。本研究大黃的總蒽醌及5個游離蒽醌成分的含量均達到了《中國藥典》2020年版規(guī)定的標準（總蒽醌不得少于1.5%）。整體上，對游離蒽醌類成分而言，青海天峻和澤庫，四川理縣、冕寧和新龍，甘肅永登、天祝和肅南以及西藏昌都等居群的含量較高，總蒽醌在四川南江、山西沁水、云南香格里拉、陜西眉縣等居群中含量較高。

2.6 PCA、PLS-DA和OPLS-DA判別分析結果

含量測定結果表明，地理距離較近的大黃中蒽醌類成分含量的相似度較高，因此擬采用PCA、PLS-DA以及OPLS-DA的分析方法對5個游離蒽醌成分的含量進行分析。將本研究27個居群的大黃進行含量測定后獲得的數(shù)據(jù)使用SIMCA-P 14.1進行統(tǒng)計學分析，得到的PCA結果如圖3所示，結果表明，第1主成分（PC 1）解釋了85.14%的方差，第2主成分（PC 2）解釋了11.25%的方差，即前2個因子可解釋原變量的96.39%的信息。PCA將27個居群的大黃從地理上大致分為了2組，一組包括甘肅肅南、青?，斍?、四川理縣、云南小中甸等16個居群，另外一組包括陜西周至、山西沁水、湖北興山、寧夏涇源等11個居群，這2組與大黃傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)和非道地產(chǎn)區(qū)相吻合。對這2個組的居群分別進行PLS-DA和OPLS-DA分析，結果如圖4和5所示。在提前分組的基礎上，PLS-DA和OPLS-DA分析的得分圖結果均顯示2個組能明顯分開且第1、2主成分共能解釋超過99.99%的差異，對模型的可靠性進行假設檢驗，其結果證明此模型較可靠。

C-蘆薈大黃素 D-大黃酸 E-大黃素 F-大黃酚 G-大黃素甲醚

圖3 27個居群大黃的PCA圖

2.7 聚類分析結果

將含量測定結果的數(shù)據(jù)經(jīng)過IBM SPSS Statistics 20進行標準化后，使用組內(nèi)聯(lián)接法為聚類方法，Squared Euclidean Distance為測量距離方進行聚類分析，結果見圖6。結果表明，27個居群的大黃被大致分為2大支，其中，除陜西平利居群（SNPL）外其余的陜西居群、山西沁水、湖北興山、河南內(nèi)鄉(xiāng)、重慶南川、四川南江及寧夏涇源居群聚為一支；甘肅、青海、西藏、云南的所有居群及除南江以外的四川居群則聚為另一大支，在這一大支中，云南香格里拉居群則單獨聚為一小支。

2.8 統(tǒng)計學檢驗結果

將27個居群的大黃按照上述結果分為道地產(chǎn)區(qū)（16個居群）和非道地產(chǎn)區(qū)（11個居群）2組，然后使用Student′s t test的統(tǒng)計學檢驗方法研究總蒽醌及5個游離蒽醌成分在這2組中的差異性（圖7）。結果表明游離蒽醌類中的蘆薈大黃素和大黃素的含量2大產(chǎn)區(qū)之間具有顯著性差異（＜0.05），大黃酸的含量在2大產(chǎn)區(qū)之間差異性極顯著（＜0.01），而大黃酚和大黃素甲醚在2大產(chǎn)區(qū)之間差異不顯著?？傒祯诘赖睾头堑赖禺a(chǎn)區(qū)之間差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 27個居群大黃的PLS-DA得分圖(左) 和置換檢驗圖(右)

圖5 27個居群大黃的OPLS-DA (左)和置換檢驗圖(右)

圖6 基于大黃蒽醌類成分的聚類圖

3 討論

3.1 測定成分的選擇

目前大黃中已明確化學結構的成分有160多個，包括蒽醌及其苷類、蒽酮及其苷類、鞣質類、二苯乙烯類、苯丁酮類等成分，其作為道地性形成的物質基礎，在大黃道地性的研究中具有重要價值[22]。蒽醌類成分是大黃中含量最多的活性成分，也是大黃的主要藥效成分[11,23]，同時也是《中國藥典》2020年版大黃質量控制的重要指標，因此本研究選擇測定總蒽醌及5個游離蒽醌成分作為研究大黃品質差異的指標。

**P < 0.01 *P < 0.05

3.2 結果分析

藥材的有效成分組成及含量是中藥材品質的重要體現(xiàn)，而藥效成分的生物合成與積累是遺傳和環(huán)境長期協(xié)同進化的結果[24-25]。本研究以野生大黃為研究對象，從居群水平分析了野生大黃的主要藥效成分蒽醌類成分的含量。27個大黃原植物居群可聚為2大支，除個別居群外，這2大支分別對應傳統(tǒng)上劃分的大黃道地和非道地產(chǎn)區(qū)。如采自甘肅、青海和四川的居群大多聚為一支，然而采自四川的南江居群卻與非道地產(chǎn)區(qū)的居群聚為一大支。推測造成上述聚類結果的可能原因是四川境內(nèi)地勢復雜，其中四川南江在自然區(qū)域上屬于秦巴山區(qū)，而理縣和新龍縣則位于川西高原，不同地區(qū)之間小氣候的差異導致藥效成分之間的積累存在差異，從而影響基于成分分析的聚類結果，然而該結果卻與課題組前期對大黃原植物遺傳層面的分析結果相吻合[9-10]。綜合遺傳和化學成分的分析結果，表明不能單純的以行政區(qū)域來劃定某種藥材的道地產(chǎn)區(qū)，而應該重視在居群水平上的研究，并以山脈、盆地或河谷等自然區(qū)劃來區(qū)分藥材的道地與非道地產(chǎn)區(qū)也許更為合理。另外，本研究野生大黃中的總蒽醌及5個游離蒽醌成分的含量，在四川、甘肅和青海的大多數(shù)居群中均較高，此結果也得到了商彤等[26]以青海所產(chǎn)大黃為種源，分別在四川若爾蓋、甘肅宕昌和河北沽源進行同質園實驗結果的證實，即游離蒽醌類成分的含量是受遺傳和環(huán)境共同影響。課題組前期大量的野外資源調(diào)查也表明，大黃原植物喜冷涼、光照充足且較為潮濕的環(huán)境。因此，無論是野生還是栽培的大黃原植物，多生長于降水較多、海拔較高的地區(qū)，這些生境有利于蒽醌類成分的積累。統(tǒng)計學分析結果顯示蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸在兩大類群間有顯著差異，且除大黃酚外其余4個游離蒽醌成分的含量在道地產(chǎn)區(qū)均比非道地產(chǎn)區(qū)高，而總蒽醌在兩大類群間差異不顯著。現(xiàn)代藥理實驗表明，游離蒽醌類成分是大黃清熱解毒、抑菌消炎的主要成分，不同于結合蒽醌和二蒽酮類以泄下作用為主[27-29]，因此，道地產(chǎn)區(qū)的大黃可能在清熱抑菌等方面優(yōu)于非道地產(chǎn)區(qū)的大黃。然而，本研究主要是基于《中國藥典》2020年版中大黃的含量測定，大黃道地性的物質基礎除了總蒽醌和游離蒽醌成分以外，還包括結合蒽醌類、二蒽酮類及鞣質類等成分，因此，今后擬將以上成分納入大黃質量評價研究，以期深入揭示野生大黃在不同分布區(qū)的品質差異。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Content determination of anthraquinone and quality evaluation of the population of source plants of rhubarb based on HPLC

[1]ZHU Hong-hong1, 2, HOU Xiao-qi3, ZHANG Miao4, ZHOU Tao1, FENG Li1, WANG Xu-mei1, 2

1. School of Pharmacy, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061, China 2. Key Laboratory ofResources and Anti-tumor Activities, Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine, School of Pharmacy, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China 3. Guiyang Medicinal Botanical Garden, Guiyang 550002, China 4. Lixian Spring Pharmaceutical Co. Ltd., Longnan 742200, China

To provide a reference for the study of the geoherblism formation of rhubarb, the content of total anthraquinone and five free anthraquinone compounds of source plants of rhubarb collected from 27 populations of 11 provinces were determined.Amethyst C18-H column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was chosen, the mobile phase consisted of methanol-0.1% phosphoric acid water (85:15) with isocratic elution at a flow of 1.0 mL·min-1, and the column temperature was 30°C. The detection wavelength was set at 230 nm. The results were analyzed using multiple statistical methods (e.g., principal components analysis (PCA), partial least squares discrimination analysis (PLS-DA), orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) and cluster analysis).The content of total anthraquinone and five free anthraquinone compounds was in accord with the standard of Chinese Pharmacopoeia, and the rhubarb from different populations could be divided into two clusters, which is consistent with the traditional geoherb and the non-geoherb areas. In addition, the content of three compounds, namely aloe-emodin, emodin and rhein, in the geoherb areas were significantly higher than that of non-geoherb areas.There are significant differences among the anthraquinone content from different populations, which can be used as the index to evaluate geoheblism of rhubarb.

et; anthraquinone; aloe-emodin; emodin; rhein; quality evaluation; distribution pattern; fingerprint

R286.2

A

0253 - 2670(2021)17 - 5295 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.022

2021-08-06

國家自然科學基金資助項目（31770364）

朱紅紅（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎及中藥質量評價。Tel: 18434824942 E-mail: zhh3073405237@stu.xjtu.edu.cn

王戌梅，女，沈陽藥科大學2009級中藥資源學博士校友，博士生導師，教育部高等學校中藥學類專業(yè)教學指導委員會《藥用植物學》課程聯(lián)盟理事，陜西省天然藥物學會常務理事，主持國家自然科學基金項目3項，主持省部級項目8項，獲陜西省科學技術研究成果二等獎1項。研究方向為中藥學。Tel: 13109529573 E-mail: wangxumei@mail.xjtu.edu.cn

[責任編輯 時圣明]