范妙璇，傅欣彤，陳奕菲，陳思妮，陳 晶，張 婷，陳有根

·藥材與資源·

三線(xiàn)定量膠體金免疫親和試紙法定量中藥飲片中黃曲霉毒素B1及B1、B2、G1、G2總量的研究

范妙璇，傅欣彤*，陳奕菲，陳思妮，陳 晶，張 婷，陳有根

北京市藥品檢驗(yàn)所，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

利用三線(xiàn)膠體金側(cè)流向免疫色譜技術(shù)，針對(duì)中藥特點(diǎn)對(duì)樣品前處理和檢測(cè)曲線(xiàn)進(jìn)行研究，建立快速、準(zhǔn)確的定量測(cè)定中藥飲片中黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2總量的方法，迅速檢測(cè)中藥飲片中黃曲霉毒素的污染程度。利用膠體金免疫親和法建立《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定限度的24種中藥飲片中黃曲霉毒素測(cè)定方法，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)60種中藥飲片，共計(jì)195批次樣品進(jìn)行分類(lèi)測(cè)定。同時(shí)利用液質(zhì)聯(lián)用（三重四級(jí)桿質(zhì)譜法）對(duì)上述樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，并比對(duì)2種檢測(cè)方法。采用配對(duì)檢驗(yàn)法比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異；通過(guò)加入其他真菌毒素對(duì)試紙條的特異性進(jìn)行考察。通過(guò)膠體金側(cè)流向免疫色譜技術(shù)測(cè)定中藥飲片中黃曲霉毒素含量，膠體金方法和液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)結(jié)果一致，無(wú)顯著性差異，加樣回收率為80.3%～119.7%，與黃曲霉毒素M1和M2、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮等其他真菌毒素沒(méi)有交叉反應(yīng)。單獨(dú)研究黃曲霉毒素B1與B1、B2、G1和G2總量之間無(wú)交叉干擾，且其含量測(cè)定符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)要求。膠體金檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確、定量、快速檢測(cè)中藥飲片中黃曲霉毒素含量。該方法具有簡(jiǎn)單、快捷和低毒等優(yōu)點(diǎn)。

黃曲霉毒素；三線(xiàn)膠體金側(cè)流向免疫色譜技術(shù)；膠體金免疫親和法；中藥飲片；液質(zhì)聯(lián)用法；赭曲霉毒素；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮

真菌毒素污染被世界衛(wèi)生組織列為食源性疾病的重要根源，其中黃曲霉毒素的危害最大[1-3]。黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，以黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）的危害和毒性最大[4-5]。1993年AFTs被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類(lèi)致癌物[6]。AFTs是一類(lèi)毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，其毒性相當(dāng)于氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，可引起肝臟的急慢性損害，同時(shí)還對(duì)腎臟等其他多種組織器官造成嚴(yán)重?fù)p害,并具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用[7-10]。因此各國(guó)相繼制定了食品中AFTs限量的法規(guī)，以保護(hù)健康[11-15]。

為了加強(qiáng)中藥材的質(zhì)量控制，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局增加了中藥材的安全性指標(biāo)控制項(xiàng)目，尤其是加強(qiáng)對(duì)中藥材中AFTs的控制，《中國(guó)藥典》2020年版中增加了AFTs的檢查方法，并針對(duì)24種中藥材及飲片開(kāi)展AFTs檢查，并明確規(guī)定了AFB1的限量不得超過(guò)5 μg/kg、AFTs總量（以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2總量計(jì)）的限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg[16]。

目前，AFTs的檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）[17-26]和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[27]。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，尤其是三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、選擇性好、抗基質(zhì)背景干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，多用于復(fù)雜基質(zhì)的檢測(cè)[28-33]，其目前也被《中國(guó)藥典》2020年版四部AFTs檢查法作為仲裁的驗(yàn)證法應(yīng)用[16]?！吨袊?guó)藥典》中規(guī)定的儀器檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確，但標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，前處理復(fù)雜，液相及質(zhì)譜法檢測(cè)儀器昂貴，飲片生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)檢測(cè)均有一定的困難，無(wú)法滿(mǎn)足廉價(jià)、快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。在檢測(cè)黃曲霉菌技術(shù)的發(fā)展中還有膠體金免疫色譜法、毛細(xì)管電泳法、生物傳感器法、熒光免疫分析熒光偏振免疫分析法、膜基質(zhì)免疫分析法、免疫芯片檢測(cè)法等[34-35]。膠體金技術(shù)檢測(cè)AFTs的方法具有快速、簡(jiǎn)便、低毒等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)開(kāi)始應(yīng)用于糧食飼料領(lǐng)域[36-39]，其不僅能夠檢測(cè)糧油、飼料、水稻以及玉米等谷物中AFB1、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1等微生物毒素，還檢測(cè)牛奶中三聚氰胺、水產(chǎn)品中氯霉素和硝基呋喃代謝物等非法添加劑、食物中副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌以及農(nóng)藥重金屬的殘留[40-41]。但是中藥中膠體金快速檢測(cè)受到基質(zhì)干擾問(wèn)題非常大。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)不同的中藥基質(zhì)AFT污染差異性較大，中藥材柏子仁與薏苡仁本身所含有的成分可以為霉菌的生長(zhǎng)提供充足的養(yǎng)分，產(chǎn)毒真菌在這2種油脂與淀粉類(lèi)基質(zhì)中容易大量繁殖，導(dǎo)致AFT污染率高[42]；大棗等提取液較黏的樣品，存在糖、黏液質(zhì)和大分子蛋白等基質(zhì)的干擾；陳皮、使君子、檳榔、蜈蚣等色素干擾較大的樣品都會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。所以亟需建立適用于中藥檢測(cè)的特殊前處理方式及結(jié)果矯正曲線(xiàn)等新的膠體金AFTs檢測(cè)方法研究。

膠體金技術(shù)又稱(chēng)側(cè)流向免疫色譜技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物應(yīng)用于樣品中待測(cè)物檢測(cè)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)，可用于樣品中待測(cè)物質(zhì)的快速定性或定量檢測(cè)，是一種穩(wěn)定、靈敏的檢測(cè)方法[43-45]。其反應(yīng)原理為試樣提取液中的AFTs與檢測(cè)條中的膠體金微粒發(fā)生反應(yīng)，AFTs與膠體金微粒的結(jié)合物以及游離的膠體金微粒在側(cè)流作用下移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)線(xiàn)時(shí)，包被的抗原與游離膠體金微粒結(jié)合，膠體金微粒富集后呈現(xiàn)紅色，其顏色深淺與試樣中AFTs的含量相關(guān)。用配套讀數(shù)儀測(cè)定檢測(cè)條上檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出試樣中AFTs的含量[46-47]，通常只能進(jìn)行定性檢測(cè)，無(wú)法準(zhǔn)確定量；而市場(chǎng)上少數(shù)可用于定量測(cè)定的二線(xiàn)試紙存在無(wú)法抗基質(zhì)背景干擾而出現(xiàn)假陽(yáng)性率高、定量曲線(xiàn)不穩(wěn)定、且檢測(cè)范圍較窄，無(wú)法稀釋后檢測(cè)等問(wèn)題。而本方法中使用的AFTs定量檢測(cè)條，則針對(duì)這一情況在技術(shù)上做了改進(jìn)，增加了一條檢測(cè)線(xiàn)，形成三線(xiàn)定量檢測(cè)條，即包括2條檢測(cè)線(xiàn)和1條質(zhì)控線(xiàn)，同時(shí)使用讀數(shù)儀，實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣品的準(zhǔn)確定量。三線(xiàn)定量檢測(cè)條的意義在于可以增加定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，同時(shí)能夠增加定量檢測(cè)的范圍，檢測(cè)范圍較其他膠體金檢測(cè)條更寬。

此外與傳統(tǒng)食品檢測(cè)不同，中藥的基質(zhì)背景復(fù)雜，色素黏液質(zhì)及中藥中不同有效成分（如黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、菲醌類(lèi)化合物等）都會(huì)給膠體金檢測(cè)帶來(lái)不同程度的影響。根據(jù)此情況，研發(fā)出幾種不同的前處理方法，分別解決此問(wèn)題，以使膠體金可以作為一種中藥AFTs通用的檢測(cè)方法。并且針對(duì)中藥基質(zhì)背景干擾的問(wèn)題，重新對(duì)內(nèi)部工作曲線(xiàn)進(jìn)行矯正，針對(duì)中藥精確度要求高，含量范圍大等特點(diǎn)本研究開(kāi)發(fā)了3個(gè)讀數(shù)曲線(xiàn)進(jìn)行低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的檢測(cè)。該研究利用競(jìng)爭(zhēng)法原理，在傳統(tǒng)免疫分析的基礎(chǔ)上引入膠體金快速檢測(cè)方法，發(fā)展出AFTs膠體金免疫快速定量檢測(cè)技術(shù)。該方法實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確、快捷、低毒等優(yōu)點(diǎn)，10～30 min完成前處理，10 min內(nèi)可完成1～4個(gè)樣品的定量檢測(cè)，順應(yīng)了快速檢測(cè)的發(fā)展方向。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

ROSA定量讀數(shù)儀、ROSA 45 ℃恒溫孵育器、黃曲霉毒素全封閉三線(xiàn)定量檢測(cè)條、黃曲霉毒素B1全封閉三線(xiàn)定量檢測(cè)條購(gòu)自北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司；IKA A11basic中藥粉碎機(jī)、VORTEX 2渦旋振蕩儀，購(gòu)自德國(guó)IKA公司；XPE204千分之一分析天平，購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；DT5-2B離心機(jī)，購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為高純水，甲醇、乙腈均為色譜純。

賽默飛世爾超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（UHPLC-TSQ Quantum），美國(guó)賽默飛世爾公司，配有二極管陣列檢測(cè)器（PDA）、電噴霧離子源（ESI）、Xcalibur工作站等。

1.2 樣品與對(duì)照品

共收集河北、安徽、江蘇、云南、天津、重慶、北京等省市的市售遠(yuǎn)志、大棗、使君子、麥芽、柏子仁、蓮子、桃仁、酸棗仁、薏苡仁、檳榔、僵蠶、全蝎、水蛭、肉豆蔻、陳皮、地龍、胖大海、決明子、蜈蚣、蜂房、九香蟲(chóng)、延胡索、土鱉蟲(chóng)、馬錢(qián)子等60種中藥飲片樣品，每個(gè)品種2個(gè)批次。共計(jì)120個(gè)批次。經(jīng)北京市藥檢所杜小偉主管藥師鑒定均為正品，具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

續(xù)表1

對(duì)照品AFTB1（批號(hào)L19044A）、AFTB2（批號(hào)L18323B）、AFTG1（批號(hào)L15331C）、AFTG2（批號(hào)L15391A）、AFTM1（批號(hào)L19082M）、AFTM2（批號(hào)1I00F12）、伏馬毒素B1（批號(hào)L18183F）、赭曲霉毒素A（批號(hào)L19122A）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（批號(hào)1I00F04）、玉米赤霉烯酮（批號(hào)L18351Z），以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，均購(gòu)自美國(guó)Supelco公司。

2 方法

2.1 樣品準(zhǔn)備

參照《中國(guó)藥典》2020年版藥材和樣品取樣法（通則0211）進(jìn)行取樣。取代表性的樣品50 g，用粉碎機(jī)將樣品粉碎至全部通過(guò)二號(hào)篩，充分混合均勻。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 樣品提取方法1 遠(yuǎn)志、大棗、使君子、麥芽、柏子仁、蓮子、桃仁、酸棗仁、薏苡仁、僵蠶、水蛭、全蝎、巴戟天、人參、太子參、紅參、紅花、何首烏、蒲公英、甘草片、牛膝、板藍(lán)根、黃芪、法半夏、澤瀉、淡豆豉、延胡索、椒目、六神曲、神曲。

取代表性均勻粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，精密稱(chēng)取樣品2 g至離心管中；加入4 mL（遠(yuǎn)志、大棗、使君子、麥芽、柏子仁、蓮子、桃仁、酸棗仁、薏苡仁、僵蠶、水蛭、全蝎、巴戟天、人參、太子參、紅參、紅花、何首烏、牛膝、板藍(lán)根、法半夏、澤瀉、淡豆豉、延胡索、椒目、六神曲、神曲）或6 mL（蒲公英、甘草片、黃芪）70%甲醇，渦旋振蕩2 min；4500 r/min離心10 min（離心后的樣品在2 h內(nèi)使用）；精密量取100 μL離心后的上清液至含有1.0 mL黃曲霉稀釋緩沖液的離心管中，作為供試品溶液（樣品上清液加入稀釋緩沖液中如果有沉淀，可充分混勻后進(jìn)行離心，取離心后上清液檢測(cè)）。

2.2.2 樣品提取方法2 肉豆蔻、胖大海、地龍、梔子、三七、魚(yú)腥草、車(chē)前草、焦神曲、金銀花、炒白術(shù)、蜂房、土鱉蟲(chóng)、玉竹、九香蟲(chóng)、白茅根、知母、白花蛇舌草、茯苓、枳殼、馬錢(qián)子、炒枳殼。

取代表性均勻粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，精密稱(chēng)取樣品2 g至離心管中；加入4 mL（肉豆蔻、胖大海、梔子、三七、焦神曲、金銀花、炒白術(shù)、蜂房、土鱉蟲(chóng)、玉竹、九香蟲(chóng)、白茅根、知母、白花蛇舌草、茯苓、枳殼、馬錢(qián)子、炒枳殼）或6 mL（地龍、車(chē)前草）或8 mL（魚(yú)腥草）甲醇（可根據(jù)樣品特性加大提取液比例），渦旋振蕩2 min；4500 r/min離心10 min（離心后的樣品在2 h內(nèi)使用）；精密量取100 μL離心后的上清液至含有1.0 mL黃曲霉的稀釋緩沖液（聚山梨酯20-磷酸鹽緩沖液）的離心管中，充分混勻，10 000 r/min離心5 min，作為供試品溶液（樣品上清液加入稀釋緩沖液中如果有沉淀，可充分混勻后進(jìn)行離心，取離心后上清液檢測(cè)）。

2.2.3 樣品提取方法3 決明子、蜈蚣、銀杏葉、陳皮、虎杖、檳榔。

取代表性均勻粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，精密稱(chēng)取樣品2 g至離心管中；加入4 mL甲醇溶液，渦旋振蕩2 min；4500 r/min離心10 min；取上清液過(guò)NH2鍵合硅膠（500 mg/3 mL）萃取小柱，收集濾液；精密量取100 μL濾液至含有1.0 mL 黃曲霉稀釋緩沖液的離心管中，充分混勻，作為供試品溶液（樣品上清液加入稀釋緩沖液中如果有沉淀，可充分混勻后進(jìn)行離心，取離心后上清液檢測(cè)）。

2.2.4 樣品提取方法4 大黃、大青葉、黃連。

取代表性均勻粉末（過(guò)二號(hào)篩）樣品，精密稱(chēng)取樣品2 g至離心管中；加入10 mL 85%乙腈溶液，渦旋振蕩2 min；4500 r/min離心10 min；取上清液過(guò)NH2鍵合硅膠固相萃取柱（500 mg/3 mL），收集濾液；精密量取2.5 mL濾液，用20 mL水進(jìn)行稀釋?zhuān)靹蛳♂屢?；移取醇活化C18固相萃取柱（500 mg/3 mL）（3 mL甲醇及3 mL水分別淋洗小柱使活化），把混勻后的稀釋液全部過(guò)活化過(guò)的C18固相萃取柱，然后用5 mL水淋洗柱子；用1 mL甲醇洗脫C18固相萃取柱，收集洗脫液；精密量取100 μL洗脫液至含有1 mL黃曲霉稀釋緩沖液的離心管中，充分混勻，此為一次稀釋液，用于檢測(cè)。

2.3 供試品溶液稀釋液的制備

如果供試品溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)30 ng/g需要進(jìn)行二次稀釋?zhuān)壕芰课　?.2”項(xiàng)方法制備的供試品溶液300 μL至含有1.0 mL黃曲霉稀釋緩沖液的離心管中，充分混勻，作為供試品溶液稀釋液。

2.4 膠體金免疫色譜方法定量檢測(cè)

取ROSA黃曲霉毒素定量檢測(cè)條和AFTs稀釋緩沖液，恢復(fù)至室溫（20～25 ℃）；孵育器溫度 （45±1）℃。緩慢移取300 μL稀釋的提取液檢測(cè)條樣品室中。孵育5 min，孵育結(jié)束后，取出檢測(cè)試紙條放至室溫下，水平放置10 min。將檢測(cè)試紙條插入讀數(shù)儀。選擇對(duì)應(yīng)頻道，選擇相應(yīng)的AFTs讀數(shù)，讀取結(jié)果。該方法的檢測(cè)范圍為0～150 μg/kg，共3個(gè)讀數(shù)頻道。頻道1讀取質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10 ng/g的樣品，靈敏度為0.01 ng/g；頻道2讀取質(zhì)量分?jǐn)?shù)10～30 ng/g的樣品，靈敏度為1 ng/g；頻道3讀取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30～150 ng/g的樣品，靈敏度為1 ng/g。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用色譜儀（LC/MS-MS）比對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法

2.5.1 供試品溶液的制備 取供試品粉末約15 g（過(guò)二號(hào)篩），精密稱(chēng)定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min（攪拌速度大于11 000 r/min），離心5 min（離心轉(zhuǎn)速2500 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，量取續(xù)濾液20.0 mL，通過(guò)免疫親和柱，體積流量3 mL/min，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5.2 色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為10 mmol/L醋酸銨水溶液-甲醇，梯度洗脫：0～4.5 min，35%～85%乙腈；4.5～6.0 min，85%～100%乙腈；6.0～6.5 min，100%～35%乙腈；6.5～10.0 min，35%乙腈；柱溫25 ℃；體積流量0.3 mL/min。

以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；電噴霧離子源（ESI），釆集模式為正離子模式；各化合物監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞電壓（CE）見(jiàn)表2。

2.5.3 系列混合對(duì)照品溶液的制備 精密量取AFTs混合對(duì)照品溶液（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的標(biāo)示質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含AFB2、AFG2質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96、1.92、2.88 ng/mL，含AFB1、AFG1質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、3.2、6.4、9.6 ng/mL的系列對(duì)照品溶液，即得。參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2351 AFTs測(cè)定法第二法進(jìn)行檢測(cè)。

表2 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對(duì)照品監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓參考值

3 結(jié)果與分析

3.1 方法專(zhuān)屬性

膠體金側(cè)流向免疫色譜快速定量檢測(cè)方法特異性實(shí)驗(yàn)。

3.1.1 AFB1特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取空白70%甲醇（平行6份），蓮子、薏苡仁、地龍、酸棗仁陰性樣品（平行2份），加入AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5、20、50 μg/kg）、AFM1對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、AFM2對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、玉米赤霉烯酮對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、伏馬毒素B1對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、赭曲霉毒素A對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg），除添加AFTs對(duì)照品的樣品可以檢測(cè)出AFTs外，其余添加樣品測(cè)定結(jié)果均為陰性，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.1.2 AFTs總量特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選取空白70%甲醇（平行6份），蓮子、薏苡仁、地龍、酸棗仁陰性樣品（平行2份），加入AFB1對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5、20、50 μg/kg），AFB2、AFG1、AFG2混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg），AFM1對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、AFM2對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、玉米赤霉烯酮對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg）、伏馬毒素B1對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg），赭曲霉毒素A對(duì)照品溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 μg/kg），除添加AFTs對(duì)照品的樣品可以檢測(cè)出AFTs外，其余添加樣品測(cè)定結(jié)果均為陰性，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.2 膠體金側(cè)流向免疫色譜快速定量檢測(cè)方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將空白樣品進(jìn)行加標(biāo)，目標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.5、5、8、10、50、80、130 μg/kg。分別做6個(gè)平行，置于室溫下[48]進(jìn)行樣品檢測(cè)。經(jīng)系列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)孵育結(jié)束后，將膠體金條水平放置10 min，可以觀察到膠體金條的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯色清晰，且穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果RSD＜5%，說(shuō)明放置10 min讀數(shù)檢測(cè)方法的穩(wěn)定性良好。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 AFB1特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n = 6)

ND-未檢測(cè)到

ND-not detected

表4 AFTs總量特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n = 6)

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n = 6)

3.3 加樣回收率試驗(yàn)

3.3.1 AFB1 取樣品2.0 g，共9份，根據(jù)不同樣品本底的結(jié)果，選擇低、中、高3水平分別添加對(duì)照品總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5、20、50 μg/kg的對(duì)照品，每個(gè)加標(biāo)水平平行3份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算各加樣水平樣品的加樣回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，加樣回收率為80.3%～119.7%，RSD為0.1%～9.9%。

3.3.2 AFTs總量 取樣品2.0 g，共9份，根據(jù)不同樣品本底的結(jié)果，選擇低、中、高3水平分別添加對(duì)照品AFB1質(zhì)量濃度為5、10、50 μg/kg的對(duì)照品，每個(gè)加標(biāo)水平平行3份，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算各回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，加樣回收率為80.6%～118.6%，RSD為0.4%～13.2%。

3.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

3.4.1 樣品的AFB1檢測(cè) 按照上述供試品溶液制備方法，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。120批次樣品中，AFB1的檢出率為97.5%，但是檢測(cè)結(jié)果都低于5 μg/kg的限度。結(jié)果見(jiàn)表7。

3.4.2 樣品的黃曲霉總量的檢測(cè) 檢測(cè)按照上述供試品溶液制備方法，進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。120批次樣品中，AFTs總量的檢出率為90.8%。98.3%樣品低于10 μg/kg的限度，有2個(gè)批次超出，為遠(yuǎn)志樣品。結(jié)果見(jiàn)表7。

3.5 膠體金側(cè)流向免疫色譜快速定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

3.5.1 AFB1三線(xiàn)膠體金快速定量法與LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法 分別對(duì)60種陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，采用配對(duì)檢驗(yàn)法比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異。經(jīng)計(jì)算，值為0.669，自由度為59，＞0.05，說(shuō)明膠體金快速定量檢測(cè)方法與藥典中LC/ MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表7。

3.5.2 AFTs總量 三線(xiàn)膠體金快速定量法與LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法分別對(duì)60種中藥飲片的61批次樣品（其中遠(yuǎn)志樣品為2批次）進(jìn)行平行比對(duì)檢測(cè)，采用配對(duì)檢驗(yàn)法比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在顯著性差異。經(jīng)計(jì)算值為?0.053，自由度為59，＞0.05，說(shuō)明三線(xiàn)膠體金快速定量檢測(cè)方法與藥典中LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法之間無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 60種中藥樣品三線(xiàn)膠體金AFTs檢測(cè)及方法學(xué)驗(yàn)證(n = 3)

續(xù)表6

表7 60種中藥飲片 (61批次)中AFB1及AFTs總量的膠體金法和LC/MS-MS法檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表7

4 討論

本研究對(duì)60種不同種類(lèi)中藥飲片建立了三線(xiàn)膠體金側(cè)流向免疫色譜檢測(cè)AFB1及AFB1、AFB2、AFG1、AFG2總量方法，同時(shí)進(jìn)行分類(lèi)測(cè)定方法，對(duì)該本方法的穩(wěn)定性、特異性、準(zhǔn)確度以及加標(biāo)回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)跟藥典LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)，差異較小。

經(jīng)系列數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)孵育結(jié)束后將膠體金條水平放置10 min讀數(shù)可以觀察到膠體金條的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)顯色清晰，且穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果良好。

試驗(yàn)樣品中，多數(shù)檢測(cè)出AFTs，AFB1的檢出率為90.8%，AFTs總量的檢出率為97.5%。樣品中有2個(gè)批次AFTs總量超出10 μg/kg的限度，均為遠(yuǎn)志樣品。除與儲(chǔ)藏運(yùn)輸?shù)葪l件有關(guān)，也與遠(yuǎn)志特殊的炮制方法以及非產(chǎn)地加工等原因有關(guān)，在外源性安全控制中應(yīng)加以注意。

研究結(jié)果可以看出，本方法的檢測(cè)結(jié)果和藥典LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果相吻合，AFB1和總量2種方法的線(xiàn)性關(guān)系值為0.999 5與0.999 2。配對(duì)檢驗(yàn)法表明膠體金快速定量檢測(cè)方法與藥典中LC/MS-MS標(biāo)準(zhǔn)方法之間無(wú)顯著性差異。加標(biāo)嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和赭曲霉毒素，檢測(cè)結(jié)果都顯示未檢出，特異性好，與其他真菌毒素沒(méi)有交叉反應(yīng)，加樣回收率為80.3%～119.7%。

與LC/MS-MS方法相比，三線(xiàn)膠體金試劑條檢測(cè)法單、快捷，10 min內(nèi)可完成1～4個(gè)樣品的定量檢測(cè)，順應(yīng)了快速檢測(cè)的發(fā)展方向。同時(shí)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員培訓(xùn)，檢測(cè)成本低，在醫(yī)院、藥店、中藥材及飲片企業(yè)以及藥材采購(gòu)環(huán)節(jié)的實(shí)際工作中，無(wú)需特殊儀器設(shè)備和試劑，可以大批量檢測(cè)中藥材及中藥飲片中AFTs，極大的提高工作效率，具有較高的應(yīng)用價(jià)值[49]。并且操作過(guò)程無(wú)需使用毒素對(duì)照品溶液，滿(mǎn)足各種檢測(cè)的需求，整個(gè)操作過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)于檢測(cè)人員的健康起到最大程度的保護(hù)。

本研究建立適用于中藥檢測(cè)的特殊前處理方式、結(jié)果矯正曲線(xiàn)等新的方法研究，并為中藥行業(yè)定量控制AFTs，制定一種低毒快速環(huán)保的測(cè)定方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)具有很大意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王晶. 食品安全快速檢測(cè)技術(shù) [M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2002: 90.

[2] 李峻媛, 萬(wàn)麗, 楊美華. 真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)及其在中藥中的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2011, 42(3): 602-609.

[3] 趙飛, 焦彥朝, 連賓, 等. 黃曲霉毒素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(5): 123-126.

[4] Huertas-Pérez J F, Arroyo-Manzanares N, Hitzler D,. Simple determination of aflatoxins in rice by ultra-high performance liquid chromatography coupled to chemical post-column derivatization and fluorescence detection [J].2018, 245: 189-195.

[5] Choochuay S, Phakam J, Jala P,. Determination of aflatoxin B1 in feedstuffs without clean-up step by high-performance liquid chromatography [J].2018, 332(6): 1-8.

[6] 劉利曉, 張亮, 向艷娥, 等. 飼料中黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究進(jìn)展 [J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2016, 37(3): 33-35.

[7] 李書(shū)國(guó), 陳輝, 李雪梅, 等. 糧油食品中黃曲霉毒素檢測(cè)方法綜述 [J]. 糧油食品科技, 2009, 17(2): 62-65.

[8] 曹紀(jì)亮, 孔維軍, 楊美華, 等. 真菌毒素快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展 [J]. 藥物分析雜志, 2013, 33(1): 159-164.

[9] 張奇, 李培武, 陳小媚, 等. 黃曲霉毒素免疫檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全, 2013(3): 42-46.

[10] 胡振陽(yáng), 都立輝, 袁康, 等. 稻谷黃曲霉毒素的檢測(cè)與污染控制研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2020, 35(1): 175-185.

[11] 食品中黃曲霉毒素的測(cè)定[S]. GB/T5009.22-2016, 2016.

[12] 飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定半定量薄層色譜法[S]. GB/T 8381—2008, 2009.

[13] 飼料中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定免疫親和柱凈化－高效液相色譜法[S]. GB/T 30955—2014, 2015.

[14] 聶晶, 劉興玠. 黃曲霉毒素M1研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué): 衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 1992(3): 159-161.

[15] 飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定膠體金法 [S]. NY/T 2550—2014, 2014.

[16] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 80.

[17] 李佐卿. 免疫親和柱HPLC快速測(cè)定蜂蜜中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 [J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2001, 18(1): 28-311.

[18] 楊小麗, 韋日偉, 申紅紅, 等. 免疫親和柱凈化光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定動(dòng)物類(lèi)藥材中黃曲霉毒素 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2011, 20(15): 4-5.

[19] 鄭榮, 毛丹, 王少敏, 等. 11種中藥材中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的HPLC法測(cè)定 [J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(5): 368-372.

[20] 徐一達(dá), 袁曉, 王海鳴, 等. 色譜法檢測(cè)真菌毒素的研究進(jìn)展 [J]. 糧油食品科技, 2018, 26(6): 54-61.

[21] 張鵬, 張藝兵, 趙衛(wèi)東. 花生中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的多功能凈化柱-高效薄層色譜分析 [J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 1999, 18(6): 62-64.

[22] 涂文升. 高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)食品中四種黃曲霉毒素 [J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 36(5): 343-345.

[23] 李海礁, 喻東威, 劉志楠, 等. 谷物中黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法的研究 [J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2013, 34(21): 83-85.

[24] 高秀潔, 鄧中平, 焦紅, 等. 黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展 [J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 8(12): 1297-1300.

[25] 楊小麗, 韋日偉, 申紅紅, 等. 免疫親和柱凈化光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定動(dòng)物類(lèi)藥材中黃曲霉毒素 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2011, 20(15): 4-5.

[26] 林維宣, 李繼業(yè), 田苗. 單克隆免疫親和柱-高效液相色譜法測(cè)定牛乳中黃曲霉毒素M1[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2000(6): 24-26.

[27] 張愛(ài)婷, 石延榜, 張振凌, 等. ELISA法測(cè)定部分種子和果實(shí)類(lèi)中藥黃曲霉毒素B1含量 [J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2008, 37(10): 48-49.

[28] 王少敏, 許勇, 毛丹, 等. HPLC-MS/MS法測(cè)定中藥桃仁中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1[J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(5): 907-911.

[29] 林建忠, 鄒偉, 張志剛, 等. LC/MS/MS測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1的研究 [J]. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué), 2004(S1): 31-33.

[30] Jaimez J, Fente C A, Vazquez B I,. Application of the assay of aflatoxins by liquid chromatography with fluorescence detection in food analysis [J]., 2000, 882(1/2): 1-10.

[31] 劉笑笑, 丁輝, 吳福祥, 等. 雜質(zhì)吸附固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定糧食中15種真菌毒素 [J]. 糧油食品科技, 2021, 29(1): 155-167.

[32] Urusov A E, Zherdev A V, Dzantiev B B. Use of gold nanoparticle-labeled secondary antibodies to improve the sensitivity of an immunochromatographic assay for aflatoxin B1 [J]., 2014, 181(15): 1939-1946.

[33] 王督, 張文, 李培武, 等. 膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2014, 36(4): 529-532.

[34] 閔曼, 潘浣鈺, 李豐. 中藥中黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展 [J]. 廣東化工, 2021, 48(5): 223-224.

[35] 陳靖文. 黃曲霉素的檢測(cè)方法及預(yù)防措施 [J]. 科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新, 2019(20): 47-48.

[36] 徐振斌, 胡東青, 里南, 等. 膠體金免疫層析法快速定量檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素 [J]. 糧食科技與經(jīng)濟(jì), 2013, 38(3): 24-26.

[37] 王桂芳, 劉美辰, 曹陽(yáng), 等. 膠體金測(cè)試條法對(duì)糧食中黃曲霉毒素B1快速定量測(cè)定的研究 [J]. 糧食科技與經(jīng)濟(jì), 2013, 38(6): 17-18.

[38] 王海彬. 花生中黃曲霉毒素免疫層析快速定量技術(shù)研究 [D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2012.

[39] 李耀磊, 劉麗娜, 姚云, 等. 基于膠體金免疫層析技術(shù)對(duì)中藥材中黃曲霉毒素B1的定量檢測(cè)研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2019, 54(17): 1432-1437.

[40] 翟培, 韓晉輝. 膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2020(4): 225-227,229.

[41] 龔頻, 王思遠(yuǎn), 陳雪峰, 等. 膠體金免疫層析試紙條技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2019, 40(13): 358-364.

[42] 單利楠, 王玉丹, 豆小文, 等. 四種大宗常用中藥飲片中黃曲霉毒素污染狀況分布比較研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2020, 22(10): 3718-3725.

[43] Piermarini S, Volpe G, Micheli L,. An ELIME-array for detection of aflatoxin B1 in corn samples [J]., 2009, 20(4): 371-375.

[44] 左曉維. 糧食中真菌毒素的熒光定量免疫層析技術(shù)研究 [D]. 重慶: 西南大學(xué), 2019.

[45] 楊杰, 李迎秋. 膠體金免疫層析技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2017, 42(10): 171-175.

[46] Masinde L A, Sheng W, Xu X,. Colloidal gold based immunochromatographic strip for the simple and sensitive determination of aflatoxin B1and B2in corn and rice [J]., 2013, 180(9/10): 921-928.

[47] 劉曉玥, 侯亞楠, 呂麗卿. 飼料中黃曲霉毒素B1快速篩查膠體金免疫層析檢測(cè)方法應(yīng)用研究 [J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2017(18): 64-65.

[48] 孫夏榮, 葛曉明, 王建花. QuEChERS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中藥飲片中黃曲霉毒素 [J]. 中國(guó)藥業(yè), 2020, 29(11): 44-47.

[49] 邵偉, 巴澤忠, 管樹(shù)舫, 等. 赭曲霉毒素A膠體金快速檢測(cè)試劑條的研制 [J]. 糧食與飼料工業(yè), 2013(8): 58-62.

Quantitative study of total amount of aflatoxins B1 and B1, B2, G1 and G2 in Chinese herbal pieces by colloidal gold immunoaffinity method

FAN Miao-xuan,FU Xin-tong, CHEN Yi-fei, CHEN Si-ni, CHEN Jing, ZHANG Ting, CHEN You-gen

Beijing Key Laboratory of Analysis and Evaluation on Chinese Medicine, NMPA Key Laboratory for Quality Evaluation of Traditional Chinese Patent Medicine, Beijing Institute for Drug Control,Beijing 102206, China

A rapid and accurate method for quantitative determination of aflatoxins B1, B2, G1, and G2 in Chinese herbal pieces was established by using colloidal gold-side flow immunochromatography, and the pollution level of aflatoxins in prepared slices of Chinese herbal pieces was determined rapidly.The content of aflatoxin in 24 kinds of Chinese herbal pieces was determined by colloidal gold immunoaffinity method, and the results were compared by liquid mass spectrometry. The pairedtest was used to compare whether there was significant difference between the two methods. The specificity of the test strip was investigated by adding other fungal toxins. Tonga calculated the recovery rate.Theaflatoxin content in the Chinese herbal pieces were determined through side to immune colloidal gold chromatography technology. The test results of colloidal gold method and LC-MS/MS method were consistent. There was no significant difference, result in three levels in the low recovery rate was between 80.3% and 119.7%, and aflatoxin M1 and M2, ochre and aspergillus toxin, vomiting toxins and corn gibberellic ketene and other mycotoxins had no cross reaction, which met the requirements.Colloidal gold assay can be used for accurate, quantitative and rapid determination of aflatoxins in prepared slices. The method has the advantages of simplicity, rapidity and low toxicity.

total aflatoxins; immune colloidal gold lateral-flow technology; colloidal gold immune affinity method; Chinese herbal pieces; LC-MS method; ochratoxin; deoxynivalenol; zearalenone

R283.6

A

0253 - 2670(2021)17 - 5275 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.020

2021-07-23

范妙璇，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析。Tel: (010)52779500 E-mail: fmxzhy@126.com

傅欣彤，沈陽(yáng)藥科大學(xué)54期中藥專(zhuān)業(yè)校友；北京市藥品檢驗(yàn)研究院中藥室主任，主任藥師；現(xiàn)為國(guó)家藥典委員會(huì)第十一屆藥典委員；國(guó)家及北京市科技獎(jiǎng)勵(lì)辦評(píng)審專(zhuān)家；北京市新藥審評(píng)專(zhuān)家；北京中醫(yī)藥大學(xué)兼職專(zhuān)碩導(dǎo)師；參與國(guó)家科技部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局、北京市科委等課題項(xiàng)目；曾獲北京市科學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，三等獎(jiǎng)3項(xiàng)，北京市中醫(yī)管理局科技成果二等獎(jiǎng)2項(xiàng)；從事藥品檢驗(yàn)、藥品標(biāo)準(zhǔn)研究工作30年；主要研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail: fuxintong68@163.com

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