楊 超，朱曉釵，萬浩婷，劉 晴，劉 曉*，蔡寶昌, 2*

基于灰色關聯(lián)分析方法研究炒酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠作用譜效關系

楊 超1，朱曉釵1，萬浩婷1，劉 晴1，劉 曉1*，蔡寶昌1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061

采用基于灰色關聯(lián)分析方法的譜效相關研究手段篩選炒酸棗仁發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效物質基礎。ip對氯苯丙氨酸建立大鼠失眠模型，造模結束后ig給予炒酸棗仁水煎液，分別于給藥后不同時間點采集各實驗組大鼠大腦皮層、下丘腦及血漿樣品，采用酶聯(lián)免疫試劑盒方法測定相關藥效指標，建立各個藥效指標的效應-時間曲線；同時利用UHPLC-Q-TOF-MS分析技術對其中化學成分進行監(jiān)測，建立各成分的響應強度-時間曲線，使用灰色關聯(lián)統(tǒng)計方法，對各藥效指標的效應-時間曲線與各成分的響應強度-時間曲線分別進行擬合，計算得到各成分與藥效的相關度，再將代謝產(chǎn)物歸屬為原型化學成分，進行權重計算，得到相關系數(shù)，并進行排序，客觀反映炒酸棗仁水煎液中化學成分與藥效的動態(tài)發(fā)展過程和內在聯(lián)系。于大鼠大腦皮層、下丘腦及血漿中共發(fā)現(xiàn)藥物相關移行成分23種，其中7種為原型成分，16種為代謝產(chǎn)物。灰色關聯(lián)分析結果表明，斯皮諾素、山茶苷B、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、維采寧-2、蓮心季銨堿、去甲異紫堇定、酸棗仁堿F、白樺脂酸共8種化學成分的相關系數(shù)較高。推測斯皮諾素、山茶苷B、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、維采寧-2、蓮心季銨堿、去甲異紫堇定、酸棗仁堿F、白樺脂酸為炒酸棗仁發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的主要化學物質基礎。

酸棗仁；炒制；鎮(zhèn)靜催眠；譜效相關；灰色關聯(lián)度；斯皮諾素；山茶苷B；6′′′-阿魏酰斯皮諾素；維采寧-2；蓮心季銨堿；去甲異紫堇定；酸棗仁堿F；白樺脂酸；UHPLC-Q-TOF-MS

酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗Millvar.(Bge.) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，味甘酸、性平，歸心、肝、膽經(jīng)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有養(yǎng)心益肝、安神、斂汗之功[1-2]。酸棗仁中化學成分主要為黃酮碳苷類、皂苷類、三萜類、生物堿、脂肪油等[3]；藥理作用主要為鎮(zhèn)靜催眠、抗驚厥、抗心律失常、改善心肌缺血、增強免疫、保護神經(jīng)系統(tǒng)等[4-6]。酸棗仁作為典型的種子類中藥，臨床應用前需經(jīng)炒制入煎，酸棗仁經(jīng)炒制后其在性狀及化學成分上均發(fā)生改變：酸棗仁經(jīng)炒制后其種皮開裂，略有焦香氣逸出；酸棗仁中有效成分及有效部位的含量經(jīng)炒制后發(fā)生一定變化[6-9]。目前，已有酸棗仁有效成分的相關研究多圍繞生品展開，而針對臨床最為常用的炒酸棗仁活性成分的報道卻十分有限。

中藥中化學成分的多樣性和復雜性及其發(fā)揮藥效作用的整體性和模糊性決定了全面、合理、準確地發(fā)現(xiàn)中藥中的有效成分并以此作為評價中藥的質量成為中醫(yī)藥研究過程中的一大難題。譜效關系法指的是采用中藥化學成分的“譜”與中藥臨床作用的“效”結合的方式發(fā)現(xiàn)中藥藥效物質基礎、對中藥內在質量進行評價的方法[10-11]。其中化學成分的“譜”多為指紋圖譜或特征圖譜，具有整體性和模糊性特點；“效”多選擇能夠代表中藥藥效的指標，同時應具備經(jīng)典、簡便、靈敏的特征，以此適于與“譜”的數(shù)據(jù)結合起來進行數(shù)理統(tǒng)計方法分析，形成“譜”“效”相關聯(lián)的數(shù)理模型[12-14]。

目前，譜效相關法在中藥有效成分的研究中所采用的的數(shù)據(jù)處理方法有相關分析、回歸分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析、主成分分析、聚類分析、灰色關聯(lián)度分析等，其中灰色關聯(lián)度分析是目前應用較為廣泛的數(shù)據(jù)處理方法[15-17]。

為了闡明炒酸棗仁中與其鎮(zhèn)靜催眠作用密切相關的藥效物質基礎，直接服務臨床合理用藥與藥品有效質控，本研究開展炒酸棗仁水煎液對對氯苯丙氨酸（-chlorophenylalanine，PCPA）模型大鼠鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效評價，同時基于UHPLC-Q-TOF- MS分析技術檢測大鼠大腦皮層、下丘腦及血漿中藥物化學成分的變化，并采用基于灰色關聯(lián)度分析方法的譜效相關法來發(fā)現(xiàn)酸棗仁炒制后的藥效物質基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UHPLC-Q-TOF-MS質譜聯(lián)用系統(tǒng)：Shimadzu 30AD超高效液相色譜系統(tǒng)，Shimadzu LC20ADXR 四元泵，SIL20ACXR自動進樣器，CT020AC柱溫箱，日本島津公司；Q-TOF-MS/MS 5600＋質譜儀，ESI離子源，美國AB Sciex公司；Micro型離心機，美國Thermo Fisher公司；Milli Q純水儀，美國Merk公司；甲醇、乙腈，UHPLC-MS級，德國Merk公司；超純水，自制；甲酸，UHPLC-MS級，美國ACS恩科化學試劑有限公司。

1.2 藥物

實驗用生酸棗仁飲片產(chǎn)于山東，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室李偉東教授鑒定為正品，基原為鼠李科棗屬植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子。

PCPA，批號AK-80383，美國Ark Pharm公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），GE Healthcare Life Sciences，批號SH30256.01。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)檢測試劑盒（批號YFXER00123）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）酶聯(lián)檢測試劑盒（批號YFXER00887）、多巴胺（dopamine，DA）酶聯(lián)檢測試劑盒（批號YFXER00053）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）酶聯(lián)檢測試劑盒（批號YFXER00023）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯(lián)檢測試劑盒（批號YFXER00022）。

1.3 動物

雄性SD大鼠66只，體質量（200±20）g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，合格證編號：No. 311620400011760，適應性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度及光照穩(wěn)定，飲食、飲水均自由。所有動物實驗遵循南京中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法

2.1 供試品提取液的制備

取生酸棗仁飲片適量，置炒制容器內，文火加熱，用紅外測溫儀測量藥溫，保持藥溫為130～150 ℃，炒制時間約為7 min至鼓起，色微變深，取出，放涼[1,18]。所得炒酸棗仁飲片依《中國藥典》2020年版中“酸棗仁”項下進行檢驗，其中水分、酸棗仁皂苷A與斯皮諾素含量均符合要求。

稱取炒酸棗仁粉末（過60目篩），加入10倍量水浸泡15 min后，武火煮沸后調至中火保持微沸，煎煮1 h，2層紗布濾出藥液，剩余藥渣加入8倍量水煎煮1 h，2層紗布濾出藥液，于60 ℃條件下低壓濃縮，將藥液濃縮至2.00 g/mL[19]。

2.2 大鼠分組與PCPA失眠模型建立

大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，將66只雄性SD大鼠隨機分為11組，每組6只，分別為給藥1～11組，每組大鼠先ip PCPA（350 mg/kg）造模[20-21]，于每天8:00～9:00時注射，連續(xù)2 d，觀察大鼠活動明顯增加，毛發(fā)豎起，同時結合生理生化指標的測定確定造模是否完成。

2.3 大鼠給藥與取材

于造模完成后的第1天9:00時按照大鼠體質量對所有給藥組的大鼠ig給予炒酸棗仁水煎液（15 g/kg），并于給藥后0.5、1、2、4、8 h，對給藥1～5組的大鼠進行眼底靜脈叢取血，取血后，將大鼠脫頸處死，并于冰上迅速取出下丘腦、大腦皮層。此后連續(xù)6 d，每天9:00時對剩余6～11組大鼠進行ig并于第2、3、4、5、6、7天給藥30 min后進行眼底靜脈叢取血和下丘腦、大腦皮層的取材。將每個時間點所取得的血漿和下丘腦、大腦皮層凍存于?80 ℃待測。

2.4 樣品制備

大腦皮層、下丘腦及血漿樣品采用蛋白沉淀法進行處理：將組織樣品用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗去除表面殘留的血液及雜質，稱定質量，記錄后剪碎，組織質量與PBS體積比例按1∶9加入預冷的PBS勻漿，4 ℃條件下5000 r/min離心10 min，取上清2 mL加入5倍量甲醇，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液以同樣的條件再離心5 min，上清液存于4 ℃?zhèn)溆?；?00 μL血漿樣品 于2 mL離心管中，加入5倍量甲醇，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液以同樣的條件再離心5 min，上清液存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5 液相色譜條件

色譜柱為Waters C18反相色譜柱（Acquity UPLC BEH C18，100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫程序：0～1 min，5%～45%乙腈；1～20 min，45%～95%乙腈；20～22 min，95%～100%乙腈；22～23 min，100%乙腈；柱溫為室溫；體積流量0.3 mL/min；進樣量3 μL。

2.6 質譜條件

質譜掃描模式為正、負離子分別進行。噴霧輔助氣體：霧化氣（Gas 1）379.21 kPa（55 psi）；輔助加熱器（Gas 2）379.21 kPa（55 psi）；氣簾氣241.32 kPa（35 psi）；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（ISVF）：+4500 V/?4500 V；去簇電壓（DP）+60 V/?60 V；碰撞能量（CE）+60 V/?60 V；TOF MS掃描范圍/100～2000；TOF MS/MS掃描范圍/50～1500。

2.7 數(shù)據(jù)處理

Analyst TF 1.6軟件采集并處理由UHPLC-Q- TOF-MS得到的原始數(shù)據(jù)，收集化合物保留時間、分子質荷比、質量誤差、二級碎片信息、響應值等主要參數(shù)信息以進行化合物歸屬和結構推斷。通過檢索CNKI、PubMed、ChemiBook、SciFinder等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫收集整理酸棗仁化學成分的有關信息，建立包含化學成分名稱、分子式、mol結構式等信息的數(shù)據(jù)庫以供后續(xù)化學成分的匹配鑒定[22]。Peakview 1.2軟件用以化學成分的匹配鑒定，鑒定過程包括一級質量數(shù)匹配和二級碎片結構匹配。

3 結果

3.1 腦和血液中藥物相關移行成分特征圖譜建立

檢測所得的正、負離子模式下大鼠大腦皮層、下丘腦及含藥血漿基準峰色譜圖（base peak chromatograms，BPC）見圖1。利用Peakview軟件、MetabolitePilot 2.0.2軟件對生物樣品中化學成分進行鑒定，篩選出各時間點均有響應的成分以供后續(xù)灰色關聯(lián)計算，共鑒定出23種源于酸棗仁水煎液的化學成分及其在大鼠體內的代謝產(chǎn)物，包括7種原型化合物與16種代謝產(chǎn)物。其中，大鼠大腦皮層、下丘腦、血漿中分別檢出8、9、14種，具體信息見表1～3。

3.2 不同時間點藥效指標獲得

PCPA失眠模型建立后，可見大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動不停，皮毛蓬松少光澤，產(chǎn)生一定的興奮性行為，出現(xiàn)互相攻擊現(xiàn)象，同時經(jīng)檢測大鼠大腦皮層及下丘腦中5-HT、GABA、DA、NE、IL-1β含量發(fā)現(xiàn)，模型組與空白組的藥效指標具有明顯差異，說明造模成功。經(jīng)給藥后，檢測各組大鼠大腦皮層、下丘腦中各項藥效指標含量，比較發(fā)現(xiàn)，炒酸棗仁水煎液組的大鼠大腦皮層中5-HT、GABA、NE、IL-1β以及下丘腦中的DA、NE的含量較模型組具有顯著性差異，因此這6項藥效指標被用于后續(xù)譜-效相關實驗。各給藥組大鼠藥效指標檢測結果見表4。

圖1 正、負離子模式下大鼠大腦皮層 (A)、下丘腦 (B)、血漿 (C) 樣品質譜檢測BPC圖

表1 基于UHPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)檢測得到的大鼠大腦皮層中的相關化學成分

表2 UHPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)檢測得大鼠下丘腦中的相關化學成分

表3 UHPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng)檢測得到大鼠血漿中的相關化學成分

3.3 譜效關系研究

灰色系統(tǒng)理論對系統(tǒng)動態(tài)發(fā)展過程量化分析以考察系統(tǒng)諸因素之間的相關程度，其主要方法一方面是根據(jù)兩序列間發(fā)展過程或量級的相似性構造關聯(lián)度，另一方面是通過反映兩序列發(fā)展趨勢或曲線形狀的相似性構造關聯(lián)度，該種通過發(fā)展趨勢或曲線形狀的相似性發(fā)現(xiàn)2個因素之間的影響程度的方法能夠為決策和判斷主要因素提供參考[23-24]。在發(fā)現(xiàn)炒酸棗仁進入體內的化學成分及其代謝產(chǎn)物的基礎上，將其與藥效指標結合進行灰色關聯(lián)計算，得出體內7種原型化學成分及16種代謝產(chǎn)物的相關系數(shù)。各成分與藥效指標的相關系數(shù)見表5～7。在確定炒酸棗仁水煎液中化學成分在體內原型及代謝產(chǎn)物的相關系數(shù)后，對所有代謝產(chǎn)物進行歸屬，將大腦皮層、下丘腦及血漿中代謝產(chǎn)物的相關系數(shù)分別進行歸一化處理，權重分配計算，再將其歸屬為原型化學成分后進行加和，計算炒酸棗仁水煎液中化學成分對其鎮(zhèn)靜催眠藥效的貢獻度，以發(fā)現(xiàn)炒酸棗仁水煎液發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效物質基礎，結果見表8。

表4 各給藥組大鼠大腦皮層、下丘腦及血漿中藥效指標檢測結果(n = 6)

“?”未檢測到

“?” not detected

4 討論

通過譜-效相關方法研究炒酸棗仁水煎液中化學成分與藥效關聯(lián)度，發(fā)現(xiàn)斯皮諾素作為其主要成分，在結合原型及體內代謝產(chǎn)物的綜合評分上，體現(xiàn)出最強藥效作用，與文獻報道一致[25-27]，其進入體內發(fā)生代謝后，產(chǎn)生的M1、M4、M6、M8、M10、M11、M12、M13、M16等代謝產(chǎn)物也表現(xiàn)出較高的相關性；山茶苷B、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、維采寧-2等黃酮類成分，其體內代謝產(chǎn)物均比其原型化學成分表現(xiàn)出更好相關性，說明中藥中的化學成分在進入體內發(fā)生代謝后同樣發(fā)揮重要的作用，這也是中藥治療疾病、發(fā)揮藥效的多樣性與復雜性的體現(xiàn)。對于生物堿類成分，由于其相對分子質量較小，結構較簡單，能夠快速到達體內，因此蓮心季銨堿、去甲異紫堇定、酸棗仁堿F在炒酸棗仁發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的過程中有著較好的相關性，這表明中藥中復雜多樣的化學成分在治療疾病時通過多成分、多靶點、多途徑的方式綜合作用而發(fā)揮藥效。

表5 大鼠大腦皮層中8種化學成分灰色關聯(lián)度及排序結果

表6 大鼠下丘腦中9種化學成分灰色關聯(lián)度及排序結果

表7 大鼠血漿中14種化學成分與5-HT灰色關聯(lián)度及排序結果

表8 炒酸棗仁水煎液中化學成分與藥效關聯(lián)度及排序結果

《中國藥典》中“酸棗仁”項下規(guī)定的含量測定的指標性成分酸棗仁皂苷A，在實驗結果中并未表現(xiàn)出良好的藥效作用，這可能是其結構較為復雜且極性較大，在體內的生物利用度較低導致其難以發(fā)揮藥效[28]。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Spectrum-effect relationship study on parchedfor its sedative and hypnotic effects based on gray correlation analysis

YANG Chao1, ZHU Xiao-chai1, WAN Hao-ting1, LIU Qing1, LIU Xiao1, CAI Bao-chang1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nanjing Haichang Chinese Medicine Corporation, Nanjing 210061, China

To find out the main chemical materials for sedative and hypnotic effects in parched Suanzaoren (, ZSS) decoction using spectrum-effect relationship based on gray correlation analysis.The model of insomnia rats was established by intraperitoneal injection of-chlorophenylalanine. After molding, decoction of parched ZSS was given by ig administration. The cerebral cortex, hypothalamus and plasma samples of rats in each group were collected, to be used for determination of pharmacodynamic indexes. The pharmacodynamic efficacy-time curves were established. Meanwhile, the chemical constituents were detected by UHPLC-Q-TOF-MS method, in which way the intensity-time curves of chemicals were obtained. The efficacy-time curves and intensity-time curves were finally fitted by gray correlation analysis. The correlation degree between each component and pharmacodynamic index was calculated and sorted, so as to reflect the dynamic development process of each component and pharmacodynamic index objectively.A total of 23 chemical constituents were found in cerebral cortex, hypothalamus and plasma in all, among which seven were prototype components and 16 were metabolites. The results of gray correlation analysis showed that the correlation coefficients of spinosin, camelliaside B, 6′′′-feruloylspinosin, vicenin-2, lotusine, norisocorydine, sanjoinine F, and betulinic acid were relatively higher.It was speculated that spinosin, camelliaside B, 6′′′-feruloylspinosin, vicenin-2, lotusine, norisocorydine, sanjoinine F and betulinic acid might be the main chemical materials in parched ZSS to exert sedative and hypnotic effects.

; stir-frying; sedative and hypnotic effects; spectrum-effect correlation; gray correlation analysis; spinosin; camelliaside B; 6′′′-feruloylspinosin; vicenin-2; lotusine; norisocorydine; sanjoinine F; betulinic acid; UHPLC-Q-TOF-MS

R283.6

A

0253 - 2670(2021)17 - 5267 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.019

2021-08-05

國家自然科學基金面上項目（81573603）

楊 超（1997—），男，江蘇揚州人，碩士研究生，主要從事中藥炮制機制研究。Tel: 15105179178 E-mail: yc1287425647@163.com

劉 曉（1981—），女，遼寧撫順人，沈陽藥科大學67期中藥學專業(yè)校友，博士，副研究員，江蘇省第五期“333高層次人才培養(yǎng)工程”培養(yǎng)對象，從事中藥炮制機制與功效物質基礎研究。Tel: 15261873181 E-mail: 300999@njucm.edu.cn

蔡寶昌（1952—），男，江蘇南京人，博士，教授，主要從事中藥飲片炮制工藝規(guī)范化研究。E-mail: bccai@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]