王 蒙，王知斌，孫延平，楊炳友，匡海學

粉防己堿對人乳腺癌MCF-7細胞線粒體能量代謝的影響

王 蒙，王知斌，孫延平，楊炳友，匡海學*

黑龍江中醫(yī)藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040

研究粉防己堿對人乳腺癌MCF-7細胞線粒體能量代謝的影響，探討其抗腫瘤作用及其機制。采用MTT法檢測粉防己堿對MCF-7細胞的細胞毒活性，評價其增殖抑制作用；通過檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）變化、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力，評價粉防己堿對MCF-7細胞線粒體功能的影響；運用細胞能量代謝分析儀對活體細胞能量代謝進行實時全過程分析，評價粉防己堿對MCF-7細胞能量代謝的影響。粉防己堿可抑制MCF-7細胞增殖，其半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值為20.13 μmol/L；粉防己堿顯著降低MCF-7細胞MMP、ATP含量、ROS水平和呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力（＜0.05、0.01）；粉防己堿可對MCF-7細胞能量代謝過程中基礎氧消耗、ATP產(chǎn)能、線粒體儲備能和質子漏產(chǎn)生影響。粉防己堿能夠通過破壞線粒體功能并減少細胞能量代謝，從而抑制MCF-7細胞增殖。

粉防己堿；乳腺癌；MCF-7細胞；線粒體功能；能量代謝

粉防己堿是一種雙芐基異喹啉類生物堿，為防己S. Moore的主要成分[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，粉防己堿具有治療免疫性疾病、心血管疾病、矽肺病和抗腫瘤等多種生物活性[2]。粉防己堿可以通過抑制細胞增殖、減少血管新生、抑制細胞遷移與侵襲、誘導細胞凋亡與自噬等途徑，影響乳腺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、膠質瘤和骨肉瘤等多種腫瘤，有效發(fā)揮抑制腫瘤生長、轉移以及逆轉多藥耐藥的作用[3-5]。

腫瘤細胞獲取能量的方式區(qū)別于正常細胞，表現(xiàn)為瓦博格效應[6]。正常分化細胞主要依靠線粒體的氧化磷酸化為細胞供能，而腫瘤細胞則主要依靠有氧糖酵解，瓦博格效應是腫瘤細胞的重要代謝特征[7]。糖酵解過程提供能量，產(chǎn)能快捷但供能效率低；氧化磷酸化過程提供能量，產(chǎn)能緩慢但供能效率高[8]。腫瘤細胞通過糖酵解獲取能量實現(xiàn)快速增殖，并以此適應腫瘤組織因快速增殖而導致的局部缺氧缺血環(huán)境[9]。因此，對腫瘤細胞線粒體功能與能量代謝過程進行干預，可以抑制腫瘤細胞增殖并促進腫瘤細胞凋亡，同時可以改變腫瘤組織周圍微環(huán)境，從而抑制腫瘤細胞遷移與侵襲。

本研究以粉防己堿對人乳腺癌MCF-7細胞進行干預，從線粒體功能變化與細胞能量代謝改變角度出發(fā)，探究粉防己堿抗腫瘤的作用機制。本研究分別對線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和位于呼吸電子傳遞鏈的復合酶I～IV活力進行檢測，考察能量代謝重要細胞器線粒體的功能變化；同時運用實時活體細胞能量代謝分析儀對粉防己堿干預的MCF-7細胞進行能量代謝過程全時分析，監(jiān)測活體細胞能量代謝動態(tài)全過程，為其深入研究及新型抗腫瘤藥物的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

MCF-7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

粉防己堿（質量分數(shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu，批號20190315）購自湖北藝康源化工有限公司；胎牛血清（批號1418110）購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)液（批號AAG204847）購自美國Hylcone公司；胰蛋白酶（批號0106A16）購自美國Sigma公司；噻唑藍（批號0793）購自美國Amresco公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（批號E001）、腺嘌呤核苷三磷酸檢測試劑盒（批號A095）、活性氧檢測試劑盒（批號E004）購自南京建成生物工程研究所；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶檢測試劑盒（批號SW040）、琥珀酸脫氫酶檢測試劑盒（批號SW041）、細胞色素還原酶檢測試劑盒（批號SW042）、細胞色素氧化酶檢測試劑盒（批號SW043）購自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 儀器

XFe24型細胞能量代謝分析儀（美國Seahorse Bioscience公司）；VICTOR X3型酶聯(lián)免疫分析儀（美國PerkinElmer公司）；Vert A1型倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）；HERACELL 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SWCJ2G型超凈工作臺（廣州瑞智凈化設備有限公司）。

2 方法

2.1 粉防己堿對MCF-7細胞增殖的影響

MCF-7細胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次。取處于對數(shù)生長期的細胞，以胰酶消化后，用培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，以8×104/孔接種于96孔板中，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h。設置對照組和粉防己堿（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/mL）組，同時選取5-Fu作為陽性對照藥物。各給藥組分別加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，加入20 μLMTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解結晶，采用酶標儀測定490 nm處吸光度（）值，計算粉防己堿各劑量組的增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）。

細胞增殖抑制率＝(對照－給藥)/對照

2.2 粉防己堿對MCF-7細胞線粒體功能的影響

取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以1×106/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。設置對照組和粉防己堿（12.5、25.0、50.0 μg/mL）組，各給藥組分別加入200 μL相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。以490 nm激發(fā)波、530 nm照射波檢測各組MMP變化；以636 nm波長檢測各組ATP含量；以500 nm激發(fā)波、525 nm照射波檢測各組ROS水平；復合酶I為NADH脫氫酶、復合酶II為琥珀酸脫氫酶、復合酶III為細胞色素還原酶、復合酶IV為細胞色素氧化酶，NADH脫氫酶檢測波長為340 nm、琥珀酸脫氫酶檢測波長為605 nm、細胞色素還原酶檢測波長為550 nm、細胞色素氧化酶檢測波長為550 nm，檢測各組呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力。

2.3 粉防己堿對MCF-7細胞能量代謝的影響

細胞能量代謝分析儀測試板和探針暗盒于無CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h進行活化。取處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞，以3×104/孔接種于24孔細胞能量代謝分析儀接種板中，加入525 μL培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設置對照組和粉防己堿（12.5、25.0、50.0 μg/mL）組，各給藥組分別加入20 μL相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。將培養(yǎng)液吸出后，加入由4.5 g/L葡萄糖、2 mmol/L丙酮酸鈉和無糖DMEM組成的測試液，于無CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。探針板測試槽中分別加入寡霉素、FCCP和魚藤酮，將接種板置于測試位校正30 min后開始檢測，儀器水化12 min后進行自檢，O2和pH值自檢合格之后進行測試。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 粉防己堿對MCF-7細胞增殖的影響

陽性對照藥物5-Fu對MCF-7細胞的IC50值為8.43 μmol/L。如表1所示，粉防己堿表現(xiàn)出明顯細胞毒活性，可抑制MCF-7細胞增殖，其IC50值為20.13 μmol/L，以此為參考確定以12.5、25.0、50.0 μg/mL 3個劑量開展后續(xù)研究。

表1 粉防己堿對MCF-7細胞增殖的影響()

3.2 粉防己堿對MCF-7細胞線粒體功能的影響

3.2.1 粉防己堿對MCF-7細胞MMP、線粒體ATP含量和ROS水平的影響 如表2所示，粉防己堿顯著降低MCF-7細胞MMP、ATP含量和ROS水平（＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。

3.2.2 粉防己堿對MCF-7細胞線粒體呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力的影響 如表3所示，粉防己堿顯著降低MCF-7細胞呼吸電子傳遞鏈復合酶I、III、IV活力（＜0.05、0.01），粉防己堿（25.0、50.0 μg/mL）顯著降低MCF-7細胞呼吸電子傳遞鏈復合酶II活力（＜0.05），且呈劑量相關性。

表2 粉防己堿對MCF-7細胞線粒體功能的影響(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

表3 粉防己堿對MCF-7細胞線粒體呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力的影響(, n = 3)

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group

3.3 粉防己堿對MCF-7細胞能量代謝的影響

細胞能量代謝分析儀可以對活體細胞的能量代謝進行實時分析，記錄細胞能量代謝全過程并通過4階段測試分析細胞的不同能量代謝狀態(tài)，粉防己堿干預MCF-7細胞的能量代謝過程見圖1。細胞能量代謝分析見表4。能量代謝分析4階段圖如圖2所示，與對照組比較，粉防己堿顯著降低MCF-7 細胞基礎氧消耗、ATP產(chǎn)能、線粒體儲備能、質子漏（＜0.01）。

圖1 粉防己堿干預MCF-7細胞能量代謝過程圖

表4 粉防己堿對MCF-7細胞能量代謝的影響(, n = 5)

A-基礎氧消耗 B-ATP產(chǎn)能 C-線粒體儲備能 D-質子漏 與對照組比較：**P＜0.01

4 討論

腫瘤細胞因具有快速增殖的特性，其代謝過程對能量的需求也相應增加[10]。腫瘤細胞表現(xiàn)出以有氧糖酵解為主的能量代謝方式，其放棄能效更高的氧化磷酸化過程，而選用能效低但產(chǎn)能快捷的糖酵解過程以滿足其對快速增殖的能量需求[11]。因此，干預腫瘤細胞的能量代謝過程也成為抑制其增殖的重要研究方向。真核細胞主要通過氧化磷酸化過程和糖酵解過程為細胞存活與增殖提供能量，葡萄糖經(jīng)過一系列酶催化為丙酮酸，再進入線粒體后經(jīng)丙酮酸脫氫酶催化為乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)[12]。線粒體作為有氧呼吸的主要場所，不僅是細胞能量代謝的中心細胞器，同時也參與細胞脂肪酸、谷氨酰胺等物質代謝過程[13]?？疾旎衔飳毎€粒體功能與能量代謝過程的影響，可以直觀評價其對細胞能量代謝的干預作用。目前，已經(jīng)有一些糖酵解抑制劑被發(fā)現(xiàn)并在腫瘤治療過程中表現(xiàn)出較好的療效。3-溴丙酮酸作為一種己糖激酶抑制劑，可有效抑制腫瘤細胞糖酵解過程從而降低ATP產(chǎn)生，使磷酸化B淋巴細胞瘤2相關X蛋白基因（B-cell lymphoma 2 associated X protein，Bax）去磷酸化誘導細胞色素C釋放，從而引起細胞凋亡[14]。氯尼達明作為吲唑-3-羧酸的一種衍生物，可以通過增加正常細胞的糖酵解速率進而抑制腫瘤細胞糖酵解速率，從而抑制腫瘤細胞的快速增殖[15]。因此，靶向腫瘤細胞的能量代謝過程是開發(fā)新型抗腫瘤藥物的一個非常有效的策略。

細胞能量代謝分析儀是近幾年來開發(fā)出的一種實時監(jiān)測活體細胞能量代謝的新技術，其極大地簡化了細胞能量代謝過程的分析步驟，是目前最為先進的細胞能量代謝測定手段[16]。儀器檢測采用固態(tài)探針，利用瞬時微室專利技術監(jiān)測溶解氧耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）反映線粒體的有氧呼吸能力，同時測量細胞能量代謝氧化磷酸化和糖酵解2條主要的產(chǎn)能鏈，可獲得細胞基礎耗氧量、ATP產(chǎn)能、線粒體儲備能和質子漏等主要指標用以反映細胞能量代謝過程中氧化磷酸化和糖酵解產(chǎn)能情況[17]。同時，該分析方法可以在不破壞細胞的條件下，對活體細胞實現(xiàn)實時能量代謝分析，獲取細胞能量代謝數(shù)據(jù)形成細胞能量代謝變化過程圖。

本研究以粉防己堿干預MCF-7細胞后，檢測細胞線粒體功能相關指標，發(fā)現(xiàn)粉防己堿可有效降低MCF-7細胞MMP，減少線粒體ATP含量和ROS水平，對線粒體產(chǎn)生破壞作用。同時，對細胞呼吸電子傳遞鏈復合酶I～IV活力進行檢測，發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以不同程度地降低NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素還原酶和細胞色素氧化酶活力，影響線粒體呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)能效率。進一步利用細胞能量代謝分析儀對粉防己堿干預后的MCF-7細胞進行實時活體細胞能量代謝分析，第1階段檢測基礎耗氧量，細胞基礎呼吸包括線粒體氧化磷酸化和質子漏耗氧，通過監(jiān)測溶解氧耗氧率以反映細胞能量代謝；第2階段加入寡霉素，寡霉素是有效的ATP合酶抑制劑，添加后減少的耗氧率可反映出細胞合成ATP的消耗從而間接顯示細胞ATP合成量；第3階段加入解偶聯(lián)劑FCCP，其造成質子回流而大量耗氧，因FCCP形成的質子回流不能生成ATP，因此增加的耗氧體現(xiàn)為細胞線粒體儲備能；第4階段加入魚藤酮，魚藤酮作為一種呼吸鏈抑制劑可以破壞線粒體，完全阻止其耗氧以檢測質子漏非線粒體產(chǎn)生的能量。粉防己堿對MCF-7細胞進行干預后，其活體細胞能量代謝顯著降低且在不同階段均呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢。通過對線粒體功能與細胞能量代謝分析，發(fā)現(xiàn)粉防己堿可以破壞MCF-7細胞線粒體功能，顯著降低MCF-7細胞能量代謝過程，從而抑制腫瘤細胞增殖。粉防己堿可抑制MCF-7細胞增殖，其IC50值為20.13 μmol/L。現(xiàn)代藥理學研究表明，粉防己堿可不同程度地對多種腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用，粉防己堿抑制腫瘤細胞增殖的IC50值為5～10 μmol/L，提示粉防己堿對腫瘤細胞線粒體能量代謝的影響可作為粉防己堿抗腫瘤作用機制的重要研究方向。粉防己堿作為一種具有顯著抗腫瘤活性的生物堿類化合物極具研究價值，細胞能量代謝儀在活體細胞能量代謝實時分析領域也表現(xiàn)出優(yōu)秀的應用能力。本研究為進一步闡明粉防己堿抗腫瘤的作用機制提供科學依據(jù)，并為細胞能量代謝分析儀在腫瘤領域的應用提供實例。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of tetrandrine on mitochondrial energy metabolism in human breast cancer MCF-7 cells

WANG Meng, WANG Zhi-bin, SUN Yan-ping, YANG Bing-you, KUANG Hai-xue

Heilongjiang Key Laboratory of Drug Efficacy Study Material of Traditional Chinese Medicine and Natural Product, Key Laboratory of Basic and Applied Research in North Medicine, Ministry of Education, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To study the effect of tetrandrine on mitochondrial energy metabolism of MCF-7 cells, explore the antitumor effect and mechanism of tetrandrine.Cytotoxicity of tetrandrine on MCF-7 cells was measured to evaluate cell proliferation inhibition by MTT assay. The changes of mitochondrial membrane potential (MMP), adenosine triphosphate (ATP) content, reactive oxygen species (ROS) level and respiratory electron transport chain complex enzyme I—IV activities were measured to evaluate the effect of tetrandrine on mitochondrial function. The real-time metabolic process of MCF-7 cells were analyzed by Seahorse Extracellular Analyzer to evaluate the effect of tetrandrine on energy metabolism.Tetrandrine inhibited the proliferation of MCF-7 cells, with the 50% concentration of inhibition (IC50) was 20.13 μmol/L. Tetrandrine significantly reduced MMP, ATP content, ROS level and respiratory electron transport chain complex enzyme I—IV activities (< 0.05, 0.01). Tetrandrine affected basal oxygen consumption, ATP production, mitochondrial reserve energy and proton leakage in the process of energy metabolism in MCF-7 cells.Tetrandrine can inhibit MCF-7 cells proliferation by damaging mitochondrial function and reducing cell energy metabolism.

tetrandrine; breast cancer; MCF-7 cells; mitochondrial function; energy metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2021)17 - 5244 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.016

2021-07-06

國家自然科學基金資助項目（81803686）；國家自然科學基金配套項目（2018PP01）；教育部“春暉計劃”合作科研項目（HLJ2019035）；黑龍江省普通本科高等學校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目（UNPYSCT-2020225）；黑龍江省博士后專項經(jīng)費資助（LBH-Q20180）

王 蒙（1987—），男，博士，主要從事中藥及復方藥效物質基礎研究。Tel: (0451)82197047 E-mail: wangmeng@hljucm.net

匡海學（1955—），男，1982年畢業(yè)于沈陽藥學院天然藥物化學專業(yè)獲得碩士學位，教授，博士，博士生導師。全國第4批學科評估A＋學科國家一級學科重點學科中藥學學科和中藥學一級博士授權學科中藥學學科帶頭人，現(xiàn)為教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室主任、國務院學位委員會第7屆學科評議組中藥學學科召集人、教育部高等學校中藥學類專業(yè)教指委主任委員、國家973計劃項目首席科學家、國家普通高校教學名師和全國中醫(yī)藥高等學校教學名師、全國優(yōu)秀博士學位論文指導教師、《中國藥典》第8～11屆委員會委員、全國優(yōu)秀科技工作者、岐黃工程首席科學家，研究方向為中藥學。Tel: (0451)82193001 E-mail: hxkuang@hljucm.net

[責任編輯 李亞楠]