宮樹(shù)一 王景續(xù) 穆勝凱

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種病程長(zhǎng)和致殘率高的自身免疫炎癥性疾病，其中骶髂關(guān)節(jié)和中軸關(guān)節(jié)病變是其典型的病理特征，過(guò)度的骨形成可引起關(guān)節(jié)強(qiáng)直和脊椎畸形，影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。成纖維細(xì)胞是脊柱韌帶和關(guān)節(jié)滑膜的主要成分，具有分化為成骨細(xì)胞的巨大潛能，是AS脊柱關(guān)節(jié)發(fā)生骨化的主要細(xì)胞[4]。目前，關(guān)于AS發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。因此，深入探討AS成纖維細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制，尋找抑制成纖維細(xì)胞成骨分化的有效分子靶點(diǎn)對(duì)治療AS具有重要意義。隨著研究的不斷深入，許多微小RNAs(miRNAs)在成骨分化和骨形成中的作用已被發(fā)現(xiàn)[5]。有報(bào)道[6]證實(shí)，miRNA-34a在炎癥條件下可抑制成骨樣細(xì)胞成骨分化，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。因此，本研究通過(guò)觀察miRNA-34a在AS滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，并探討miRNA-34a對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2017年10月至2019年5月于本院行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的5名AS患者的滑膜組織標(biāo)本，年齡26～48歲，男4例，女1例；患者均符合紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)(1984年修訂)。另收集5例創(chuàng)傷性骨折患者的滑膜組織作為對(duì)照，其中年齡介于46～55歲，男3例，女2例。所有受試者均排除髖關(guān)節(jié)滑膜炎和風(fēng)濕病等，組織標(biāo)本的收集均獲得患者及家屬的知情同以及本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且均儲(chǔ)存于-80 ℃下備用。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，脂質(zhì)體2000、胰蛋白酶、Trizol試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)-PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。青鏈霉素雙抗購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Notch信號(hào)通路激活劑rhNF-κB購(gòu)于美國(guó)Progmega公司。BCIP/NBT溶液購(gòu)于中國(guó)華興博創(chuàng)生物公司。RNA提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)QIACEN公司，miRNA-34a mimics(F：5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3′和R：5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3′)及其陰性對(duì)照序列(F：5′-CAGUACUUUUGUGUA-GUACAA-3′和R：5′-UUGUACUACACAAAAGU-ACUG-3′)購(gòu)于廣州銳博生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1滑膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng) 采用組織塊貼壁法。以無(wú)菌的D-Hanks溶液洗滌組織標(biāo)本后，采用含1%青鏈霉雙抗的DMEM培養(yǎng)基以自然沉降法對(duì)剪碎的組織小塊(體積1 mm3)浸洗3次。收集組織塊接種于含有20%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗的DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h至組織塊貼壁。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，有細(xì)胞游出。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底85%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化、傳代。收集生長(zhǎng)良好的第四代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分組：滑膜成纖維細(xì)胞分為正常組、AS對(duì)照組、AS+NC組和AS+miRNA-34a mimics組，實(shí)驗(yàn)處理：其中除正常組外，各組細(xì)胞均AS患者的成纖維細(xì)胞，而正常組為來(lái)自創(chuàng)傷性骨折患者的正常成纖維細(xì)胞。AS+NC組和AS+miRNA-34a mimics組的細(xì)胞培養(yǎng)基添加有5 ng/mL TGF-β1和7 ng/mL BMP-2，并參照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)步驟將終濃度為50 nmol/L miRNA-34a mimics及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。后期實(shí)驗(yàn)另設(shè)AS+miRNA-34a mimics+rhNF-κB組：采用含5 ng/mL TGF-β1和7 ng/mL BMP-2的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以miRNA-34a mimics轉(zhuǎn)染滑膜成纖維細(xì)胞48 h后，給予濃度為1 g/mL的rhNF-κB作用24 h。

1.3.3成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(ALP)染色 將滑膜成纖維細(xì)胞以適當(dāng)密切接種至6孔細(xì)胞板上，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。棄培養(yǎng)液后，按照上節(jié)中的分組處理細(xì)胞。培養(yǎng)7 d后，先以磷酸緩沖液洗滌，再經(jīng)4%多聚甲醛進(jìn)行固定。固定時(shí)間為30 min。再次洗滌后，加入BCIP/NBT工作液，常溫條件下避光反應(yīng)30 min。洗滌后觀察染色情況。

1.3.4實(shí)時(shí)PCR檢測(cè) 分別參照RNA提取試劑盒和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取各組細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。取2 μL cDNA，與各1 μL上下游引物、12.5 μL的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和8.5 μL ddH2O混合配成總體積為25 μL的PCR擴(kuò)增體系。上PCR儀，按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 5 min(95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s)×40個(gè)循環(huán)、 72 ℃終延伸6 min。以U6和GAPDH為管家基因，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。其中由上海生工生物合成的PCR引物見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 miRNA-34a在AS來(lái)源的滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)

與正常組相比，AS對(duì)照組細(xì)胞中miRNA-34a的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；以TGF-β1和BMP-2作用后，AS+NC組細(xì)胞中miRNA-34a的表達(dá)水平較AS對(duì)照組明顯降低(P<0.05)；與AS+NC組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-34a mimics的AS+miRNA-34a mimics組細(xì)胞中miRNA-34a的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞中miRNA-34a的相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 miRNA-34a mimics對(duì)ALP染色結(jié)果的影響

ALP染色結(jié)果顯示，AS組和AS+NC組細(xì)胞的ALP活性明顯強(qiáng)于正常組，且AS+NC組強(qiáng)于AS組；但是，AS+miRNA-34a mimics組的ALP活性明顯低于AS+NC組。

2.3 miRNA-34a mimics對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、OCN和Runx2 mRNA表達(dá)的影響

AS組細(xì)胞中ALP、OCN和Runx2 mRNA的表達(dá)水平較正常組明顯升高，而顯著低于AS+NC組(P<0.05)；與AS+NC組相比，AS+miRNA-34a mimics組細(xì)胞中ALP、OCN和Runx2表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中ALP、OCN和Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 miRNA-34a mimics對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的影響

TGF-β1和BMP-2處理后的AS+NC組細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的Notch1受體及其下游靶基因Hes1 mRNA的表達(dá)水平較正常組和AS組明顯升高(P<0.05)；與AS+NC組相比，AS+miRNA-34a mimics組細(xì)胞中Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞中Notch1和Hes1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.5 激活Notch信號(hào)通路對(duì)miRNA-34a mimics抑制滑膜成纖維細(xì)胞成骨分化的影響

與AS+NC組相比，給予miRNA-34a mimics后，韌帶成纖維細(xì)胞中ALP、OPN和Runx2 mRNA明顯降低；而給予Notch信號(hào)通路激動(dòng)劑rhNF-κB作用后，miRNA-34a mimics對(duì)ALP、OPN和Runx2 mRNA表達(dá)的抑制作用減弱，見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞中ALP、OPN和Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

AS的發(fā)病率逐年上升且已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNAs在AS成骨分化過(guò)程中異常表達(dá)，可通過(guò)多種途徑調(diào)控成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，進(jìn)而參與AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[7-10]。

miRNA-34a屬于miRNA-34家族成員，定位于1p36染色體上，在多種組織或細(xì)胞中異常表達(dá)，在骨形成和成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-13]。miRNA-34a可抑制人牙周膜細(xì)胞成骨細(xì)胞分化[14]。TGF-β1和BMP-2是具有促成骨分化作用的兩種細(xì)胞因子，與AS病理性成骨關(guān)系密切[15-17]。本研究通過(guò)TGF-β1和BMP-2聯(lián)合作用后miRNA-34a在AS來(lái)源的滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)降低，提示miRNA-34a可能在滑膜成纖維細(xì)胞向成骨分化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ALP是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志性酶，OCN和Runx2是成骨分化的標(biāo)志蛋白，三者的表達(dá)水平是反映成骨能力的主要指標(biāo)[17-19]。Notch信號(hào)通路是一條十分保守的信號(hào)通路，Notch1是Notch受體之一，Hes1是其下游最為典型的靶基因，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化等過(guò)程，在骨形成和骨重建等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-34a表達(dá)可降低TGF-β1和BMP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞中成骨相關(guān)基因ALP、OCN和Runx2 mRNA以及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)，提示miRNA-34a過(guò)表達(dá)可抑制AS滑膜成纖維細(xì)胞成骨分化和Notch信號(hào)通路的活性。給予Notch信號(hào)通路激活劑rhNF-κB作用后，miRNA-34a mimics對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞成骨分化的抑制作用減弱，提示miRNA-34a可通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路抑制AS滑膜成纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

總之，miRNA-34a在AS滑膜成纖維細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可通過(guò)調(diào)控Notch信號(hào)通路抑制AS滑膜成纖維細(xì)胞成骨分化，這一結(jié)果豐富了AS滑膜成纖維細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制，也為改善和治療AS提供了新的線索和依據(jù)。