黃雪冰 張罕星 李凱潮 王 爽 夏偉光 張亞男 王勝林 林映才 陳 偉 鄭春田

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

豆粕型飼糧在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中被廣泛使用，由于原料玉米、豆粕等長期依賴進(jìn)口，增加了飼料成本，尋求可代替豆粕和玉米的飼料原料資源顯得尤為重要。我國棉花和油菜種植面積廣，產(chǎn)量大，經(jīng)榨油后產(chǎn)生大量的棉籽粕和菜籽粕，粗蛋白質(zhì)含量均為40%左右，是較優(yōu)的蛋白質(zhì)原料[1-2]。玉米干酒糟及其可溶物(distillers dried grains with solubles, DDGS)是玉米在生產(chǎn)酒精過程中的副產(chǎn)品，因其粗蛋白質(zhì)含量高(是玉米的3倍以上)、產(chǎn)量大，因而作為常規(guī)飼料原料的重要替代品在生產(chǎn)中應(yīng)用也越來越廣泛[3]。木薯干淀粉含量為81%～88%，是優(yōu)質(zhì)的能量原料[4]。研究表明，在28～40周齡海蘭商品蛋雞的飼糧中添加25%未脫毒棉籽粕對產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重、料蛋比、平均采食量及死淘率均無顯著影響[5]。產(chǎn)蛋雞飼糧中分別應(yīng)用4%、8%和10%雙低菜籽粕替代等量豆粕對生產(chǎn)性能無顯著影響[6]。飼糧中添加12%的菜籽粕替代部分豆粕不影響肉種雞的產(chǎn)蛋率和蛋重，還提高了種蛋受精率[7]。蛋雞飼糧中應(yīng)用20%的玉米DDGS對生產(chǎn)性能沒有不良影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)蛋期蛋雞飼糧中，木薯粉可以替代50%的玉米，換羽期可完全替代玉米[9-10]。阮棟等[11]報道，飼糧中添加9%棉籽粕對蛋鴨產(chǎn)蛋性能無顯著影響；Ruan等[12]分別在飼糧中添加8%菜籽粕和高達(dá)18%的玉米DDGS對蛋鴨的產(chǎn)蛋性能無顯著影響。以上研究表明，飼糧中應(yīng)用適量非常規(guī)原料對蛋禽生產(chǎn)性能不會產(chǎn)生負(fù)面影響。我國蛋鴨養(yǎng)殖規(guī)模位居世界首位，年存欄量約2億只，年產(chǎn)鴨蛋400萬t，蛋鴨生產(chǎn)中大量應(yīng)用非常規(guī)原料以節(jié)省成本，但目前仍不清楚長時期應(yīng)用雜粕型飼糧(非常規(guī)飼料)對蛋鴨生產(chǎn)性能及機(jī)體健康是否會產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，本試驗旨在通過對蛋鴨長時期飼喂雜粕型飼糧，研究其對蛋鴨產(chǎn)蛋性能、生殖器官及卵巢激素受體mRNA表達(dá)水平的影響，評價長時期飼喂雜粕對蛋鴨機(jī)體健康影響，為雜粕型飼糧在蛋鴨飼料中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選擇健康的19周齡福建龍巖麻鴨360羽，按體重隨機(jī)分為2組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)30只鴨[體重與品種標(biāo)準(zhǔn)體重差異<10%，各重復(fù)初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)]，采用地面+水域方式飼養(yǎng)。豆粕組(對照組)飼喂豆粕型飼糧，雜粕組飼喂雜粕型飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1，2組飼糧能量、粗蛋白質(zhì)、氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸)含量一致。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 動物飼養(yǎng)與管理

試驗鴨在試驗場(水域面積∶陸地面積=1∶3)地面平養(yǎng)，試驗期間，每天07:00和16:00各喂料1次，所有欄試驗鴨自由采食飲水。按常規(guī)程序免疫和常規(guī)操作規(guī)程飼養(yǎng)。試驗持續(xù)12個月，試驗前預(yù)飼1周。試驗期間，鴨舍光照保持16 h/d，晚上日光燈補(bǔ)光到22:00。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 產(chǎn)蛋性能

每天準(zhǔn)確記錄給料量和剩料量，統(tǒng)計試驗期間的平均日采食量。記錄各重復(fù)欄鴨每天蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)量、破蛋數(shù)量(大小、形狀、蛋殼正常，但被試驗鴨踩破的蛋)、畸形蛋數(shù)量(大小、形狀、蛋殼不正常，如過大、過小、形狀不規(guī)則、軟殼、麻殼、裂紋等)和耗料量，統(tǒng)計平均日增重、平均日采食量、產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重、料蛋比、破蛋率、畸形蛋率。

1.3.2 樣品采集

試驗結(jié)束時，試驗鴨空腹12 h后，從各重復(fù)欄中選取2只蛋鴨頸部放血致死，打開腹腔，剪斷卵巢系膜，取下卵巢稱重，記錄優(yōu)勢卵泡(直徑大于10 mm)數(shù)量和重量，計算優(yōu)勢卵泡總重與卵巢重的比值。測量輸卵管長度和重量。采集輸卵管、卵巢、肝臟、腎臟、小腸等樣品于液氮速凍后-80 ℃保存，并采集輸卵管和卵巢樣品在10%中性福爾馬林溶液中4 ℃保存。

1.3.3 組織形態(tài)指標(biāo)

輸卵管、卵巢組織固定48 h后，經(jīng)修塊、脫水、包埋、切片、石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)、脫水封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse Ni-E，日本)下觀測取圖，采用Motic Images圖像分析系統(tǒng)，測定輸卵管和卵巢的組織形態(tài)變化。

1.3.4 組織游離棉酚殘留檢測

肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管、小腸中游離棉酚含量測定參考阮棟等[11]的方法，采用高效液相色譜儀(Waters 2695，美國)測定。分離條件：Waters XBridge C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫25 ℃，流動相為甲醇-水，每100 mL溶液含0.1 mL磷酸，流速0.8 mL/min，Waters 2489紫外檢測器，檢測波長為236 nm，檢測限為1.0 mg/kg。棉酚對照品(批號111517-200001，規(guī)格20 mg)購自廣州藥品檢驗所。

1.3.5 RNA提取及熒光定量PCR反應(yīng)

采用Trizol法提取卵巢組織樣品RNA后用ND-1000紫外分光光度計(Nanodrop，美國)在OD260和OD280下檢測RNA的濃度和純度，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR，以β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，用2-△△Ct計算mRNA相對表達(dá)量。采用Primer Premier 5軟件設(shè)計卵泡激素受體(follicle-stimulating hormone receptor,FSHR)、黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor,LHR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ER1)和β-actin基因引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，實時熒光定量PCR引物信息見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物信息

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行t檢驗，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雜粕型飼糧對蛋鴨產(chǎn)蛋性能的影響

如表3所示，相比豆粕型飼糧，飼喂雜粕型飼糧的蛋鴨產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重顯著下降(P<0.05)，料蛋比顯著上升(P<0.05)。圖1-A是連續(xù)12個月飼喂雜粕型飼糧蛋鴨產(chǎn)蛋率每月變化曲線圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋鴨飼喂雜粕型飼糧期間產(chǎn)蛋率低于豆粕型飼糧，尤其在換羽期(4～5月)產(chǎn)蛋率明顯下降。圖1-B是飼喂雜粕型飼糧期間蛋鴨每月平均蛋重變化趨勢，發(fā)現(xiàn)蛋鴨飼喂雜粕型飼糧后，從1～5月連續(xù)5個月的平均蛋重低于豆粕組。圖1-C是飼喂雜粕型飼糧期間蛋鴨每月日產(chǎn)蛋重變化趨勢，相比豆粕組，雜粕組蛋鴨從11月到次年6月連續(xù)8個月的日產(chǎn)蛋重下降明顯。

表3 雜粕型飼糧對蛋鴨產(chǎn)蛋性能的影響

圖1 飼喂雜粕型飼糧蛋鴨產(chǎn)蛋率、平均蛋重和日產(chǎn)蛋重的變化趨勢

2.2 雜粕型飼糧對蛋鴨生殖器官的影響

如表4所示，與豆粕組相比，飼喂雜粕型飼糧長達(dá)12個月后對蛋鴨輸卵管長度、輸卵管重、卵巢重、優(yōu)勢卵泡個數(shù)、優(yōu)勢卵泡重均無顯著影響(P>0.05)，但有降低優(yōu)勢卵泡重/卵巢重的趨勢(P=0.083)。組織切片結(jié)果如圖2所示，飼喂豆粕型飼糧蛋鴨輸卵管固有層內(nèi)可見較多血管，未見炎性細(xì)胞浸潤，卵巢皮質(zhì)可見各級卵母細(xì)胞，發(fā)育良好，未見明顯的退行性改變。飼喂雜粕型飼糧蛋鴨輸卵管的黏膜固有層水腫明顯，腺管體積縮小，卵巢中原始卵泡增多。

表4 雜粕型飼糧對蛋鴨生殖器官的影響

圖2 雜粕型飼糧對蛋鴨輸卵管和卵巢組織形態(tài)的影響

2.3 飼喂雜粕飼糧蛋鴨組織器官中棉酚殘留情況

如表5所示，對蛋鴨組織器官中棉酚殘留檢測發(fā)現(xiàn)，豆粕組蛋鴨肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管、小腸等組織器官中均未檢測出棉酚的殘留；飼喂雜粕型飼糧蛋鴨肝臟中棉酚殘留量最高，達(dá)到81.28 mg/kg，其次腎臟中棉酚殘留量為34.70 mg/kg，卵巢和輸卵管中棉酚殘留量分別為13.28和10.88 mg/kg，在小腸中的殘留量為3.78 mg/kg。

表5 飼喂雜粕型飼糧蛋鴨組織器官中棉酚殘留情況

2.4 雜粕型飼糧對蛋鴨卵巢激素受體mRNA表達(dá)水平的影響

如表6所示，相比豆粕型飼糧，雜粕組蛋鴨卵巢組織中FSHR、LHRmRNA相對表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，同時ER1 mRNA相對表達(dá)量有下降趨勢(P=0.080)。

表6 雜粕型飼糧對蛋鴨卵巢激素受體mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 雜粕型飼糧對蛋鴨產(chǎn)蛋性能的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂雜粕型飼糧12個月顯著降低了高峰期蛋鴨產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重，同時提高了料蛋比。此結(jié)果與單獨在飼糧中添加某一種非常規(guī)飼料原料對蛋鴨產(chǎn)蛋性能的影響不盡相同。阮棟等[11]報道，飼糧中添加9%棉籽粕飼喂3個月，發(fā)現(xiàn)對蛋鴨產(chǎn)蛋性能無顯著影響，但高于9%棉籽粕對蛋鴨產(chǎn)蛋性能產(chǎn)生負(fù)面影響，如降低蛋重、提高料蛋比等。Ruan等[2]用8%的菜籽粕添加到蛋鴨飼糧中飼喂4個月，發(fā)現(xiàn)其對產(chǎn)蛋量、平均蛋重和飼料轉(zhuǎn)化率無顯著影響。Ruan等[12]報道，蛋鴨飼糧中添加高達(dá)18%玉米DDGS不會影響蛋鴨的產(chǎn)蛋量、蛋重、飼料轉(zhuǎn)化率，平均蛋重隨飼糧中玉米DDGS添加水平增加而線性下降，試驗期為18周。羅威才[3]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂金定蛋鴨1個月高達(dá)24%的玉米DDGS對產(chǎn)蛋率無顯著影響，當(dāng)添加水平為24%時料蛋比有增加的趨勢?？梢妴为氃陲暭Z中添加某一種非常規(guī)飼料原料對蛋鴨的產(chǎn)蛋性能影響不顯著，且添加劑量也較大，與本研究結(jié)果有差異，可能是由于試驗時間長短及單因子處理未能引起蛋鴨產(chǎn)蛋性能有明顯的變化。孫靜等[13]用8%～20%棉籽粕和8%～20%菜籽粕組合飼喂蛋鴨52 d，發(fā)現(xiàn)蛋重表現(xiàn)出不同程度的下降，并建議添加12%菜籽粕以及不高于8%的棉籽粕對鴨蛋加工皮蛋最適宜。在接近單獨添加某一種原料的劑量之下，聯(lián)合使用后對蛋鴨的產(chǎn)蛋性能有一定的疊加效應(yīng)。相似的結(jié)果表現(xiàn)在蛋雞的研究上，何斌[14]研究用不同水平棉籽粕(1.2%、2.4%、4.8%、9.6%、11.9%)飼糧飼喂34周齡羅曼粉殼蛋雞12周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼糧棉籽粕添加水平對蛋雞產(chǎn)蛋率、料蛋比無顯著影響，當(dāng)棉籽粕添加水平超過9.6%時顯著降低蛋重。陳連頤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在海賽克斯蛋雞飼糧中添加5%～15%棉籽粕10周，蛋雞平均產(chǎn)蛋率、平均蛋重、料蛋比與對照組相比有下降的趨勢。Panigrahi等[16]報道，用不同水平棉籽粕(75、150、300 g/kg)飼糧飼喂蛋雞10周，棉籽粕水平達(dá)到300 g/kg(游離棉酚含量255 mg/kg)時，蛋雞產(chǎn)蛋量顯著降低。Mu等[17]發(fā)現(xiàn)飼糧中添加12%棉籽粕飼喂8周，降低了蛋雞的產(chǎn)蛋率和飼料效率。Yuan等[18]發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼喂含有6%棉籽粕飼糧8周，顯著降低了平均蛋重，并提高了料蛋比。王麗娟等[19]在海蘭褐蛋雞飼糧中應(yīng)用6.3%棉籽粕和5%菜籽粕70 d，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋率、平均蛋重、產(chǎn)蛋量顯著下降，料蛋比顯著上升。研究發(fā)現(xiàn)，在40周齡蛋雞飼糧中添加8%玉米DDGS和30%木薯粉35 d，顯著降低了蛋雞產(chǎn)蛋量和飼料轉(zhuǎn)化率[20]。通過以上雜粕飼糧在蛋鴨與蛋雞的應(yīng)用試驗，可以發(fā)現(xiàn)雜粕應(yīng)用劑量及物種會造成試驗結(jié)果的差異，同時本試驗與以上試驗差異的因素還可能與試驗時間長短和雜粕應(yīng)用組合效應(yīng)有關(guān)。

3.2 雜粕型飼糧對蛋鴨生殖器官的影響

在本試驗中，飼喂雜粕型飼糧長達(dá)12個月對蛋鴨輸卵管長度、輸卵管重、卵巢重、優(yōu)勢卵泡個數(shù)、優(yōu)勢卵泡重均無顯著影響，但優(yōu)勢卵泡重/卵巢重有降低的趨勢。組織器官形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，飼喂玉米-豆粕型飼糧蛋鴨輸卵管固有層內(nèi)可見較多血管，卵巢發(fā)育良好，而飼喂雜粕型飼糧蛋鴨輸卵管的黏膜固有層水腫明顯，腺管體積縮小，卵巢中原始卵泡增多。這表明長時期飼喂雜粕型飼糧對蛋鴨生殖器官(卵巢和輸卵管)產(chǎn)生了負(fù)面影響。阮棟等[11]發(fā)現(xiàn)飼糧中9%及以上的棉籽粕3個月會明顯破壞蛋鴨優(yōu)勢卵泡的完整性，使得卵泡變形破裂，局部呈融溶狀。何斌[14]研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧中應(yīng)用9.6%和11.9%棉籽粕3個月，可引起輸卵管膨大部和子宮部空泡變性。同時研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2.5%菜籽油可導(dǎo)致蛋雞卵泡出血，蛋黃比例降低[21]。游離棉酚是棉籽粕中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，能損害肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管等實質(zhì)器官，由于其代謝緩慢，易在動物體內(nèi)蓄積，可造成長期損害[22]。本試驗發(fā)現(xiàn)，雜粕組中蛋鴨的肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管中都有不同程度的棉酚殘留，這可能是造成輸卵管和卵巢損傷的原因之一?；i歡等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼糧中棉籽粕的添加量超過100 g/kg會影響生產(chǎn)性能，雞蛋中游離棉酚殘留量會隨游離棉酚的攝入量的增加而增加，隨著飼養(yǎng)期限(24周)的延長，雞蛋中的游離棉酚殘留率會提高。焦洪超等[24]用含游離棉酚20和40 mg/kg的飼糧分別飼喂蛋雞，蛋雞飼喂5、25和45周后，其肝臟中游離棉酚的含量分別為60、185、462 mg/kg和462、642、955 mg/kg，由此表明，長時間飼喂含有棉籽粕的雜粕飼糧提高了游離棉酚在動物機(jī)體的殘留率，蓄積作用明顯。菜籽粕中的硫葡萄糖苷和芥酸含量直接影響其在畜禽飼糧中的添加量，未脫毒處理時菜籽粕飼糧添加量在5%～15%為宜，脫毒處理后，雙低菜籽粕的使用量可提高至10%～20%[6]。玉米DDGS會濃縮玉米中的霉菌毒素，其中玉米赤霉烯酮是一種類雌激素活性的毒素，主要危害畜禽生殖系統(tǒng)[25]。用于加工成木薯干的苦味木薯會含有較高含量的氫氰酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子[4]。我們推測，長時期應(yīng)用雜粕型飼糧對蛋鴨生殖器官造成不良影響有可能是幾種非常規(guī)原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子聯(lián)合作用的結(jié)果，但仍有待進(jìn)一步確定。

3.3 雜粕型飼糧對蛋鴨卵巢激素受體mRNA表達(dá)水平的影響

本試驗通過對卵巢激素受體mRNA的相對表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)，相比豆粕型飼糧，雜粕型飼糧顯著下調(diào)了FSHR、LHRmRNA相對表達(dá)量，同時有降低ER1 mRNA相對表達(dá)量趨勢。FSHR對卵泡的發(fā)育、成熟、排卵發(fā)揮著重要的作用[26-27]。有研究表明，雜種蛋雞中FSHR基因差異表達(dá)量可能是導(dǎo)致產(chǎn)蛋數(shù)量差異的重要因素[28]。此外，F(xiàn)SHR可通過介導(dǎo)環(huán)腺苷酸(cAMP)途徑發(fā)揮激素促卵泡成熟作用，卵泡激素(FSH)與顆粒細(xì)胞表達(dá)的FSHR結(jié)合后，使得芳香化酶活化，同時誘導(dǎo)LHR生成，誘發(fā)動物體排卵[29]。劉立文等[30]研究發(fā)現(xiàn)FSHR和LHR表達(dá)量下降，會導(dǎo)致柴雞的卵泡發(fā)育減緩，從而使得家禽的性成熟推遲。ER是卵母細(xì)胞胞質(zhì)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，能夠通過調(diào)節(jié)類固醇激素分泌從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟[29,31]。本試驗結(jié)果表明，飼喂雜粕型飼糧的蛋鴨產(chǎn)蛋率下降，可能與卵巢激素受體FSHR、LHR、ER1的mRNA相對表達(dá)量下降有關(guān)。

4 結(jié) 論

蛋鴨飼喂雜粕型飼糧12個月可造成產(chǎn)蛋性能下降，可能與其中含有的抗?fàn)I養(yǎng)因子通過抑制蛋鴨生殖器官生長，同時降低卵巢激素受體mRNA表達(dá)水平有關(guān)。