金小紅， 施 烜， 呂 欣

(1. 同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院麻醉科，上海 200433； 2. 南昌大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，南昌 330006)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由多種原因引起的以急性、進行性呼吸功能不全為特征的呼吸系統(tǒng)危重疾病，急性肺損傷進一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)。研究發(fā)現(xiàn)ARDS的患病率和死亡率非常高，重度ARDS死亡率可高達46.1%[1]。急性肺損傷主要損傷了肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞及巨噬細胞，導致細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，因此，從細胞和分子病理學層面探索新的治療方法和治療藥物改善細胞損傷成為當前熱點課題，由于微小RNA(microRNA, miRNA)在許多疾病中特異性表達(顯著上調(diào)或下調(diào))，并在患者血清中容易檢測且靈敏度高，因此可作為研究的重要切入點。

1 miRNA的基本分子特征

miRNA在細胞核內(nèi)合成，主要被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為初始miRNA，然后被Drosha/DGCR8復合體剪切成70～100個核苷酸的前體miRNA，再通過輸出蛋白5轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)被Dicer/TRBP復合體處理為21～25個核苷酸的雙鏈RNA分子，最后降解成單鏈的成熟miRNA與特定靶基因的3’-UTR(非翻譯區(qū))結(jié)合，降解mRNA或抑制其蛋白質(zhì)翻譯[2]。目前已通過高通量測序、基因芯片等技術(shù)篩選出大量與肺損傷相關的miRNAs，并在動物及細胞等層面驗證miRNAs參與了肺損傷的調(diào)控見表1～2。

表1 miRNAs在ALI中表達譜變化

2 與肺泡上皮細胞相關miRNAs

肺泡上皮細胞是肺泡血管屏障的主要組成部分，損傷會導致屏障功能下降，并且由于肺泡上皮完整性的破壞以及表面活性物質(zhì)合成減少導致肺水的清除障礙，最終導致肺纖維化。miRNAs通過介導多種信號通路調(diào)控細胞增殖、凋亡及炎癥因子表達，從而影響肺泡上皮細胞功能。

表2 miRNAs在各種細胞內(nèi)參與調(diào)控ALI

2.1 保護性miRNAs

在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell, ATⅡ)中miR-145-5P顯著下調(diào)[3]，人癌系肺泡Ⅱ型上皮細胞(adenocarcinomic human alveolar epithelial cell， A549)中miR-16[4]、miR-140[5]和miR-140-5p[6]也明顯下降，并且上述miRNAs均與Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)mRNA的3’-UTR結(jié)合。TLR4定位于細胞膜和細胞質(zhì)，是LPS的模式識別受體[31]，與LPS結(jié)合后觸發(fā)信號級聯(lián)效應，激活了下游NF-κB通路[32]，因此過表達miR-145-5p、miR-16、miR-140及miR-140-5p可以抑制TLR4的表達，阻斷NF-κB通路的活化，降低炎癥因子的表達，從而減輕ALI。

也有研究發(fā)現(xiàn)在高氧誘導的肺泡 Ⅱ 型上皮細胞(type 2 alveolar epithelial cell, AECⅡ、T2AEC)中miR-16表達明顯下降[33]，且LPS誘導的A549細胞中miR-216a[7]的表達也顯著下調(diào)。過表達miR-16促進細胞增殖并抑制其凋亡，這可能與TGF-β/Smad2和JAK/STAT3通路有關[33]。而miR-216a是通過靶向JAK激酶2(janus kinase, JAK2)來調(diào)節(jié)JAK2/STAT3和NF-κB信號轉(zhuǎn)導來抑制細胞凋亡、自噬及炎癥因子釋放[7]。Kloss等[34]發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad通路主要調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、凋亡和遷移等過程。而JAK/STAT通路調(diào)控細胞因子、黏附分子和炎癥因子轉(zhuǎn)錄[35]。所以miRNAs可以通過介導多種信號通路(TGF-β/Smad、JAK/STAT和NF-κB)來緩解ALI。

2.2 損傷性miRNAs

在LPS誘導ATⅡ細胞[8]和暴露于高氧的T2AEC、小鼠肺上皮細胞-12(murine lung epithelial-12， MLE12)中[19]發(fā)現(xiàn)miR-34a表達明顯升高，結(jié)果證實miR-34a可以與自噬相關基因叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3(forkhead box O3, FoxO3)[8]及血管生成素1(angiopoietin-1,Ang1)[9]的3’-UTR結(jié)合。既往研究表明FoxO3能夠抑制NF-κB的活性[36]，而Fang等[37]發(fā)現(xiàn)Ang1可以抑制人T2AEC中的NF-κB活性來恢復上皮細胞對蛋白質(zhì)的通透性。所以,miR-34a通過靶控FoxO3或Ang1介導NF-κB通路來調(diào)控肺泡上皮細胞功能。

LPS誘導的AEC模型中，靶向B淋巴細胞瘤2相關蛋白A1(B cell lymphoma 2 related A1, BCL2A1)基因的miR-326激活了NF-κB信號軸[10]，另一項研究發(fā)現(xiàn)LPS處理的A549細胞中miR-300靶控抑制性κBα蛋白(inhibitor kappa B α, ⅠκBα)，活化了NF-κB通路[11]。而在靜息狀態(tài)下,NF-κB二聚體與IκB蛋白結(jié)合后存留于胞質(zhì)中[38],當肺損傷后，細胞受到外源性刺激,NF-κB活化進入細胞核啟動了炎癥反應[39]。結(jié)果證明過表達miR-326和miR-300都可通過介導NF-κB信號通路導致促炎因子表達增加，并促進肺泡上皮細胞凋亡，而抑制miR-326和miR-300的表達則可以緩解急性肺損傷。

3 與血管內(nèi)皮細胞相關miRNAs

ALI導致血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白解聚，細胞間連接松散，最終導致血管壁通透性增加及單核細胞、淋巴細胞、多核細胞等炎性細胞聚集。miRNAs靶向血管內(nèi)皮細胞的mRNAs，參與內(nèi)皮細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變，包括對細胞周期、凋亡、細胞層通透性和炎癥信號的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控肺損傷相關內(nèi)皮細胞的功能。

3.1 保護性miRNAs

LPS誘導肺微血管內(nèi)皮細胞后發(fā)現(xiàn)miR-339-3p、miR-539-5p和miR-33均低表達。研究證實miR-339-3p靶向膜聯(lián)蛋白A3(annexin A3, Anxa3)，抑制AKT/mTOR通路[12]，而Anxa3參與調(diào)控細胞骨架蛋白的相互作用、細胞分化、增殖、凋亡和炎癥反應等[40]，且AKT/mTOR通路也調(diào)控細胞凋亡和炎癥反應[41]。熒光素酶報告基因證實Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled coil conta-ining protein kinase 1, ROCK1)是miR-539-5p的靶基因[13]，而ROCK1與ALI的氧化應激和細胞凋亡有關[42]。因此miR-339-3p和miR-539-5p都減少急性肺損傷中的細胞凋亡和炎癥因子的表達水平。miR-33與受體相互作用蛋白140表達呈負相關[14]，受體相互作用蛋白140是NF-κB輔助激活物，通過招募環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)調(diào)節(jié)促炎因子的產(chǎn)生[43]，過表達miR-33減輕了ALI的炎癥反應。

3.2 損傷性miRNAs

LPS和高氧刺激內(nèi)皮細胞(endothelial cell, EC)后，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p介導的內(nèi)皮功能障礙與組蛋白去乙?；?(sirtuin type 1, SIRT1)表達降低和p53的表達升高有關[15]，SIRT1通過介導p53促使凋亡蛋白Bax進入線粒體，導致線粒體氧化應激損傷[44-45]。LPS顯著刺激了肺微血管內(nèi)皮細胞中miR-1246和miR-92a的表達。由于miR-1246靶向血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)基因[16]，ACE2又是通過裂解AngⅡ 產(chǎn)生血管緊張素1-7來使AngⅡ 失活[46]，而AngⅡ 與受體結(jié)合調(diào)節(jié)氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡來緩解急性肺損傷[47]。結(jié)果證明抑制miR-34a-5p或miR-1246的表達可抑制氧化應激，減輕內(nèi)皮細胞凋亡，降低炎癥因子表達水平。抑制miR-92a，可以增加其靶基因整聯(lián)蛋白α5(integrin α 5, ITGA5)的表達[17]，ITGA5在細胞黏附、增殖、遷移中起著關鍵作用[48]。結(jié)果也證實ITGA5明顯增加肺微血管內(nèi)皮細胞的遷移，增強血管生成，改善內(nèi)皮細胞功能，并減少促炎因子釋放。研究顯示miR-92a與ITGA5的上述作用可能與PI3K/AKT、NF-κB通路相關[49]。

4 與巨噬細胞相關miRNAs

巨噬細胞具有吞噬、分泌等多種功能，在急性肺損傷早期，分泌多種細胞因子啟動級聯(lián)炎性反應。大量的研究表明miRNAs參與免疫調(diào)節(jié)，單核細胞的發(fā)育、分化、增殖及等中心環(huán)節(jié)。

4.1 保護性miRNAs

在LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞(mouse peritoneal macrophage cell, RAW264.7)中，miR-497和miR-30b-5p的表達下降。抑制miR-497的表達增加了白介素1受體相關激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2, IRAK2)的表達，卻抑制了NF-κB通路蛋白的表達[18]。在TLR早期，IRAK1和IRAK2都發(fā)揮重要作用，但在后期IRAK2則起著關鍵作用[50]。既往研究發(fā)現(xiàn)IRAK2參與了IL-1誘導的NF-κB通路的激活[51]。miR-30b-5p可以和細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)的3’-UTR結(jié)合[19]，而SOCS家族介導多種細胞因子的產(chǎn)生[52]，且SOCS3負調(diào)控JAK/STAT3通路介導肺巨噬細胞炎癥[53]。綜上所述，miR-497和miR-30b-5p都能抑制ALI炎癥因子的表達。

LPS導致肺泡巨噬細胞中miR-495和miR-802的表達顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)miR-495基因啟動子甲基化導致miR-495降解，活化炎癥小體3(nod like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3)，而抑制miR-495的降解可以減輕肺泡巨噬細胞的炎癥反應和焦亡，緩解ALI[20]。You等[21]證實miR-802通過靶控皮層E3泛素蛋白連接酶家族2(pellino E3 ubiquitin protein ligase family member 2, Peli2)來改善肺損傷。Peli2通過促進LPS誘導NLRP3的泛素化來介導NLRP3的激活[54]。而NLRP3與肺部炎性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關[55]。總之，miR-495和miR-802都可以通過NLRP3信號軸介導炎癥反應，改善ALI。

4.2 損傷性miRNAs

在LPS誘導RAW264.7中發(fā)現(xiàn)miR-92a及miR-34b-5p的表達明顯上調(diào)。miR-92a通過與10號染色體上的磷酸酯酶與張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten, PTEN)的3’-UTR結(jié)合并阻斷PTEN/AKT/NF-κB信號傳導途徑來抑制炎癥反應[22]。PTEN在增殖、凋亡和炎癥等多種過程中起關鍵作用，并能夠抑制PI3K/AKT信號通路[56]。研究證實原顆粒蛋白(progranulin, PGRN)是miR-34b-5p的功能靶標[23]，并在炎癥和細胞凋亡等病理過程中發(fā)揮關鍵性作用[57-58]。肺泡巨噬細胞中miR-199a直接靶控SIRT1基因[24]，SIRT1在各種類型的細胞中具有抗炎、抗氧化、抑制DNA損傷和減少細胞凋亡的作用[59-60]。因此，通過抑制miR-92a、miR-34b-5p和miR-199a的表達，減輕ALI中過度的炎癥反應和細胞凋亡，提高ALI小鼠生存率。

5 與間充質(zhì)干細胞相關miRNAs

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肺泡細胞等多種體細胞系。MSC調(diào)節(jié)免疫反應并釋放旁分泌因子，以維持屏障功能，促進組織修復并再生新組織，從而緩解ALI，而這種作用主要是由MSC衍生的外泌體包含的miRNAs引起的，而miRNAs在不同組織、不同細胞類型和不同發(fā)育階段表達量不同，在干細胞自我更新、增殖、分化、組織發(fā)育等細胞過程中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC)與A549在低氧條件下共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導UCMSC分化為ATⅡ細胞，這對于ALI的上皮再形成和恢復至關重要,主要是由miR-145通過靶向TGF-β受體Ⅱ(transforming growth factor-β receptorⅡ, TGFβRⅡ)調(diào)控的[30]，TGFβRⅡ結(jié)合后激活了TGF-β信號。光氣暴露導致ALI后，用超速離心法得到的外泌體中包含的miR-28-5p通過PI3K/AKT信號通路促進MSC的增殖及遷移并增加了IL-10的分泌，增強了旁分泌因子如： 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、抗菌肽(cathelicidin LL-37, LL-37)和Ang 1的表達[25]。使用重物致傷法建立大鼠創(chuàng)傷性ALI模型，然后注入MSC衍生的外泌體，在外泌體中大量表達miR-124-3p直接靶向嘌呤能受體P2X配體門控離子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7)[26]，而P2X7作為嘌呤能受體，與人類炎癥和應激反應密切相關[61]。P2X7敲減抑制炎癥反應而對ALI起到保護作用[62]。

6 與內(nèi)皮祖細胞相關miRNAs

內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell, EPC)作為成熟內(nèi)皮細胞的前體細胞，在維持內(nèi)皮完整、促進血管新生、保護器官功能中發(fā)揮重要作用。EPC減輕膿毒血癥肺損傷是通過內(nèi)皮祖細胞衍生的外泌體(endothelial progenitor cell-exosomes, EPC-Exos)包含miRNAs決定的。

LPS誘導大鼠模型后，用EPC-Exos移植到大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126在EPC-Exos中富集，而miR-126又通過抑制其靶點快速發(fā)育生長因子同源蛋白1(sprouty-related enabled/vasodilator-stimulated pho-sphoprotein homology 1 domain 1, SPRED1)的表達，激活了RAF/ERK信號通路，增強了人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成[27]。研究發(fā)現(xiàn)小氣道上皮細胞(small airway epithelial cell, SAEC)中miRNA-126-3p可靶向磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基2(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 2, PIK3R2)，從而抑制高速泳動族蛋白B1(high mo-bility group box-1, HMGB1)和通透性因子VEGFα的表達[28]。在LPS誘導的ALI小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(mouse pulmonary microvascular endothelial cell， MPMVEC)和EPC中，增加miR-10a/b-5p的表達或降低靶蛋白整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase15, ADAM15)的表達，促進MPMVEC增殖而發(fā)揮治療ALI的作用[29]。敲除ADAM15可以降低肺高通透性和緩解ALI，表明ADAM15在ALI中是一種促炎蛋白[63]。抑制了ADAM15的表達改善了ALI的炎癥反應。

7 與COVID-19相關miRNAs

自2019年12月以來，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)正在全球迅速蔓延。新型冠狀病毒傳染性強，死亡率高，同時癥狀隱匿，極大威脅人類生命健康。SARS-CoV-2在人類中的致病性是由于重要生理途徑改變,包括與“細胞因子風暴”和廣泛的肺部病理學改變相關。免疫應答對于控制SARS-CoV-2感染至關重要，但過度反應反而導致細胞損傷。miRNAs在天然免疫和獲得性免疫中調(diào)節(jié)免疫細胞的分化、發(fā)育和激活起著關鍵作用。

多項研究分析了SARS-CoV-2基因組，以確定哪些區(qū)域可以作為病毒編碼的miRNA種子海綿，潛在地與人miRNA種子位點結(jié)合，并阻止其與天然靶標相互作用，從而緩解天然miRNA抑制的區(qū)域。Guterres等[64]發(fā)現(xiàn)34個miRNA為順義病毒RNA，45個miRNA為反義病毒RNA，它們可以與某些關鍵的SARS-CoV-2基因緊密結(jié)合。miRNA的破壞和功能異?？赡軙_亂免疫反應并刺激炎性細胞因子的釋放，從而改變細胞對病毒感染的反應。

8 展 望

目前ALI的有效防治策略仍然是當前重點和難點問題，而miRNA可通過影響其靶基因，調(diào)控肺泡上皮細胞、毛細血管內(nèi)皮細胞及巨噬細胞功能，在ALI或ARDS發(fā)揮重要作用。此外，miRNA可作為生物標記志物，在ALI或ARDS不同病程和病情的診斷中作為重要參考指標。由于機體調(diào)控網(wǎng)絡的復雜性，同種或不同種細胞中，不同的miRNA可能調(diào)控同一個信號通路，同時在一種或多種細胞中同一個miRNA可能參與不同信號通路的調(diào)控，由于ALI或ARDS的病情進展迅速、在不同時間點呈現(xiàn)不同病理生理特點，因此miRNA可能在不同時間點或不同細胞中起著完全相反的作用。miRNA與靶基因結(jié)合影響多種信號通路，調(diào)控細胞凋亡、血管生成和免疫等多種病理生理過程，此外miRNA在不同細胞、組織及各種體液中都穩(wěn)定存在，故而特異性升高或降低利于病情發(fā)展的miRNA的表達可能成為ALI新的治療方法。miRNA現(xiàn)處于實驗室研究階段，暫時還沒有miRNA用于臨床試驗，有待進一步探索，為臨床應用提供堅實基礎。