胡靜,汪毓文,徐林忠,夏志持
麻城市人民醫(yī)院 藥劑科,湖北 麻城 438300
加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方,由金錢草、連錢草、山楂、雞內(nèi)金、車前子、滑石等12 味中藥組成,具有清熱利濕、通淋消石的功效,臨床用于濕熱引起的肝膽結(jié)石、黃疸、尿路結(jié)石、石淋、熱淋、小便澀痛等[1-3]。鑒于傳統(tǒng)湯劑臨床服用攜帶不便、質(zhì)量不可控等缺點(diǎn),為了保證臨床效果,故擬將該方開(kāi)發(fā)研制成加味結(jié)石顆粒劑。本實(shí)驗(yàn)以總黃酮提取率和干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)[6],采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)該顆粒劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選,以期為臨床院內(nèi)制劑的應(yīng)用提供參考。
53-WB 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠);WGL-230B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);QUINTIX125D-1CN 型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);HH-6型恒溫水浴鍋(江蘇中大儀器科技有限公司)。
金錢草(批號(hào):191001-X)、連錢草(批號(hào):190501-X)、山楂(批號(hào):20190801)、雞內(nèi)金(批號(hào):20191001)、車前子(批號(hào):20191001)等購(gòu)于亳州市善安堂中藥飲片有限公司,經(jīng)麻城市人民醫(yī)院藥劑科主任中藥師徐林忠鑒定為正品;對(duì)照品蘆?。兌龋?8%,批號(hào):190705,北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司);無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純)。
2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品12.61 mg,置25 mL量瓶中,加70%乙醇約20 mL,密塞,超聲使其溶解,放冷,定容,即得(0.5045mg·mL-1)。
2.1.2 樣品溶液的制備 取0.2 倍量處方中藥,加入適宜體積的水,浸泡30 min,提取相應(yīng)次數(shù),濾過(guò),濾液合并,濃縮至適量,放冷至室溫,加水定容至50 mL量瓶中,備用。精密吸取提取液5 mL,置50 mL量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,超聲20 min,濾過(guò),精密吸取續(xù)濾液2 mL置5 mL量瓶中,加70%乙醇定容至刻度,即得。
2.1.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別吸取對(duì)照品和樣品溶液各1 mL,使用硝酸鋁顯色法,于200~800 nm波長(zhǎng)處掃描,發(fā)現(xiàn)兩者均在510 nm 的波長(zhǎng)處有最大吸收(圖1),故選用510 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
圖1 加味結(jié)石湯供試品溶液和蘆丁對(duì)照品溶液紫外掃描圖
2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶 液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL,分別加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL,混勻,靜置6 min,再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL,混勻,靜置6 min,最后加4%氫氧化鈉溶液4 mL,70%乙醇定容至10 mL,混勻,靜置15 min[4]。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,在510 nm 處測(cè)吸光度,以吸光度值為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸,得回歸方程:Y=0.011 5X-0.001 1(r=0.999 8),在12.36~74.16μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。
2.1.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.037 08 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,按2.1.4 項(xiàng)下方法,連續(xù)測(cè)定6 次,RSD為0.13%,表明儀器精密性良好。
2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取同一份樣品溶液1.0 mL,按2.1.4 項(xiàng)下方法,于5、10、15、20、25、30 min測(cè)定,RSD 為0.55%,表明供試品溶液在30 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取0.2 倍量處方藥材,按照樣品制備方法(液料比為12∶1,煎煮時(shí)間為1.5 h,煎煮次數(shù)為2 次)平行煎煮6 份樣品,按2.1.4 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值并計(jì)算總黃酮含量,RSD 為1.72%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定0.1 倍量處方藥材,共6份,精密加入蘆丁對(duì)照品溶液適量(與0.1倍處方藥材所含黃酮量相當(dāng)),按照樣品制備方法(液料比為12∶1,煎煮時(shí)間為1.5 h,煎煮次數(shù)為2次)煎煮樣品,按2.1.4項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,測(cè)得平均回收率為97.78%,RSD 為2.91%,加樣回收率符合要求。
精密吸取樣品提取液20 mL,放置于蒸發(fā)皿(經(jīng)干燥至質(zhì)量恒定),在水浴中蒸干,保持105 ℃溫度條件,5 h 后于干燥器冷卻1 h。快速稱取質(zhì)量,根據(jù)公式(1)計(jì)算出膏率[5]。
式中,W為出膏質(zhì)量,M為藥材質(zhì)量,V為樣品溶液的體積。
以總黃酮含量和干膏得率為指標(biāo),采用加權(quán)綜合評(píng)分法,兩者的權(quán)重分別為50、50,按公式(2)計(jì)算綜合評(píng)分[6]。
對(duì)液料比(8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1)、煎煮時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、煎煮次數(shù)(1、2、3 次,考慮到成本和實(shí)際生產(chǎn),煎煮次數(shù)試驗(yàn)只選1、2、3 次)這些因素進(jìn)行考察,結(jié)果顯示,加水量為12 倍時(shí)綜合評(píng)分最高,煎煮時(shí)間為1.5 h時(shí)綜合評(píng)分最高,綜合評(píng)分隨著煎煮次數(shù)的增加而增加,煎煮次數(shù)為2 次時(shí),綜合評(píng)分急劇增加,當(dāng)煎煮次數(shù)達(dá)到3 次時(shí),綜合評(píng)分曲線增加變緩,說(shuō)明繼續(xù)增加煎煮次數(shù)已無(wú)實(shí)質(zhì)性意義。
2.4.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇液料比(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)3 個(gè)因素作為考察對(duì)象,每個(gè)因素三水平(表1),根據(jù)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,總共設(shè)計(jì)17組,見(jiàn)表2,采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)綜合評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表3。
表1 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平
表2 加味結(jié)石湯提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表3 回歸模型方差分析
使用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6 對(duì)表2 中各指標(biāo)性成分的綜合權(quán)重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得回歸方程:Y=97.20-0.33A-2.38B+4.53C+0.95AB-3.57AC-1.97 BC-5.22A2-11.24B2-8.16C2,3個(gè)因素中對(duì)加味結(jié)石湯提取工藝影響結(jié)果依次為C>B>A。回歸模型P<0.000 1,說(shuō)明此模型具有顯著性,且r=0.988 6,表明模型擬合度良好,失擬項(xiàng)P>0.05,表明模型失擬不顯著,試驗(yàn)誤差小,說(shuō)明可以很好地對(duì)加味結(jié)石湯的提取工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。
2.4.2 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)面曲面圖,見(jiàn)圖2,從圖2可以看出,兩兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響,隨著各因素的水平值增加,綜合評(píng)分值會(huì)出現(xiàn)一個(gè)峰值,當(dāng)各水平持續(xù)升高時(shí),綜合評(píng)分值又下降或坡度相對(duì)平緩,如隨著煎煮時(shí)間的增加,綜合評(píng)分先升高后下降,煎煮次數(shù)由1 次升高為2 次時(shí),提取效率顯著升高,當(dāng)煎煮次數(shù)增加為3 次時(shí),曲面相對(duì)平緩。使用Design-Expert 8.0.6軟件分析優(yōu)化過(guò)后的最佳提取工藝條件為液料比11.37∶1,煎煮時(shí)間1.46 h,煎煮次數(shù)2.31 次,在此條件下,綜合評(píng)分最大值為97.95??紤]到實(shí)際操作過(guò)程中的局限性,將各參數(shù)調(diào)整為液料比12∶1,煎煮時(shí)間1.5 h,煎煮次數(shù)2次。
圖2 加味結(jié)石湯各因素交互作用的響應(yīng)面圖
進(jìn)一步對(duì)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證,考察所得優(yōu)化后的提取工藝的穩(wěn)定性,按照處方比例稱取藥材3 份,加12 倍量水,煎煮2 次,每次1.5 h,測(cè)得總黃酮平均提取率為2.29%,干膏得率為22.20%,都接近響應(yīng)面法最優(yōu)數(shù)據(jù)的理論值,表明該方法準(zhǔn)確可靠。
本實(shí)驗(yàn)選擇了干膏得率和總黃酮含量作為雙指標(biāo),其原因?yàn)闈飧嗟某龈嗦蕦?duì)制劑后續(xù)的醇沉、制粒等工藝操作影響較大[7],另一方面加味結(jié)石湯方中重用金錢草、連錢草為君藥,兩者質(zhì)量占整個(gè)方子總量的40%,金錢草、連錢草主要化學(xué)成分均為黃酮類[8-10]。研究報(bào)道,金錢草的利尿排石作用機(jī)制可能為提取液中黃酮類成分的羰基和酚羥基與草酸根競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān),從而達(dá)到減少草酸鈣的形成[7,11]。
響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取,該方法試驗(yàn)次數(shù)少、周期短,求得的回歸方程精度高且能夠研究幾種因素間的交互作用[12-13],與傳統(tǒng)方法相比,能更直觀、更準(zhǔn)確得到最優(yōu)組合。
肝膽結(jié)石和泌尿系統(tǒng)結(jié)石是臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病,發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì),并嚴(yán)重危害人類的健康和生命[1,14]。加味結(jié)石湯是麻城市人民醫(yī)院傳統(tǒng)協(xié)定處方,該方以中藥傳統(tǒng)方《太平惠民和劑局方》記載的八正散(車前子、瞿麥、扁蓄、滑石、梔子、甘草、木通、大黃)加減所得[15],根據(jù)藥物特點(diǎn),可同時(shí)兼顧治療肝膽結(jié)石和尿路結(jié)石。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝,為該方開(kāi)發(fā)成治療結(jié)石的顆粒制劑提供參考。