王匯濱，許漢卿，馬佳睿，張昕彤，賀智承，于青，鄒立偉，劉東春*

1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；

2.沈陽北創(chuàng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，遼寧 沈陽 110000；

3.沈陽藥科大學(xué) 制藥工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；

4.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；

5.上海中醫(yī)藥大學(xué) 交叉科學(xué)研究院，上海 201203

人羧酸酯酶（carboxylesterases，hCE）屬絲氨酸水解酶家族，作為人體內(nèi)一類重要的代謝酶，廣泛分布于多種組織細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[1]。hCE1 和hCE2 是其中2種主要的水解酶，hCE催化各種內(nèi)源性和外源性硫酯類、碳酸酯類和酰胺類化學(xué)物質(zhì)的水解[2-3]。hCE1 和hCE2 具有47%的氨基酸序列同一性，但這2 種酶表現(xiàn)出不同的組織分布及不同的底物和抑制劑特異性[4-5]。hCE1 和hCE2 在肝臟中均存在，但以hCE1 為主[6]，而人體小腸部位的羧酸酯酶主要是hCE2[7]。

有研究表明，hCE1 在調(diào)節(jié)脂肪酸分布和控制肝臟脂質(zhì)生物合成、分泌與分布中發(fā)揮作用[8-9]。體內(nèi)高水平的葡萄糖也會(huì)誘導(dǎo)hCE1活力升高，促進(jìn)脂肪合成[6]。近期有文獻(xiàn)報(bào)道，hCE1 可能在肥胖相關(guān)的心血管危險(xiǎn)因素中起作用，并有望成為代謝綜合征的治療靶點(diǎn)[10]。hCE1 的活性在肥胖癥和2 型糖尿病患者的脂肪組織中升高，而用hCE1抑制劑治療將為脂質(zhì)代謝、糖代謝異常帶來多重有益作用。因此，hCE1已經(jīng)成為治療高脂血癥的重要靶點(diǎn)[11-12]。

在藥物代謝方面，hCE1 為絲氨酸水解酶家族的藥物代謝I 相酶，hCE1 調(diào)節(jié)劑可通過調(diào)節(jié)酯類藥物的水解速度而調(diào)節(jié)藥物的代謝速度及活性[13]。hCE1介導(dǎo)多種藥物水解過程，如洛伐他汀、非諾貝特、氯吡格雷等[2]。日常食物及中藥中存在影響hCE1 活性的物質(zhì)，從而影響藥物的效力，可能導(dǎo)致療效降低或者藥物中毒[14-15]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16-19]選取了部分具有調(diào)血脂活性的中藥材及中藥單體，考察其對hCE1 活性的影響，研究其調(diào)血脂作用與hCE1活性抑制作用的關(guān)系，為調(diào)脂類藥物的開發(fā)和藥物安全有效應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

決明子Cassiae Semen、綠茶Green Tea、胡椒Piperis Fructus、女貞子Ligustri Lucidi Fructus、干姜Zingiberis Rhizoma、梔子Gardeniae Fructus、柴胡Bupleuri Radix、山楂Crataegi Fructus、制何首烏Polygoni Multiflori Radix Praeparata、蒲 黃Typhae Pollen、紅花Carthami Flos、虎杖Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix、澤瀉Alismatis Rhizoma、地龍Pheretima、茵陳Artemisiae Scopariae Herba、玉竹Polygonati Odorati Rhizoma、荷葉Nelumbinis Folium、枳殼Aurantii Fructus 藥材購于沈陽成大方圓藥店，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)生藥教研室劉東春副教授鑒定均為正品。

甘草次酸（批號(hào)：PB171125-3）、槲皮素（批號(hào)：PB171221-6）、木犀草素（批號(hào)：PB171205-3）、水飛薊素（批號(hào)：PB171015-3）、燈盞花素（批號(hào)：PB180105-3）、黃芩素（批號(hào)：PB170821-9）、二氫楊梅素（批號(hào)：PB180305-1）、熊去氧膽酸（批號(hào)：PB170915-7）、苦參堿（批號(hào)：PB180305-5）、氧化苦參堿（批號(hào)：PB170921-4）、京尼平（批號(hào)：PB180315-1）、梔子苷（批號(hào)：PB170925-7）購于陜西帕尼爾生物科技有限公司，純度均大于98%。

無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司）；D-熒光素甲基醚（DME，上海中醫(yī)藥大學(xué)系統(tǒng)藥代動(dòng)力學(xué)中心）；Promega 雙熒光素酶報(bào)告基因（DLR）檢測試劑盒[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司]；人肝微粒體酶[HLM，瑞德肝臟疾病研究所（上海）有限公司]。

1.2 儀器

SQP QUINTIX125D-1CN 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；SCIENTZ-12N 型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MIX-3000型金屬孵育器（杭州米歐儀器有限公司）；SpectraMax iD3型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）。

2 方法

2.1 藥材提取與供試品溶液的配制

取藥材3 g，用70%的乙醇50 mL 浸取24 h 后，50 ℃超聲波提取1 h，濾過，殘?jiān)?0%乙醇30 mL再超聲提取30 min，濾過，合并濾液。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收乙醇至無醇味，加蒸餾水適量使總體積為20 mL，超聲混懸均勻，用乙酸乙酯50 mL分2 次萃取，合并萃取液。減壓旋蒸除去乙酸乙酯至干，取少量蒸餾水洗滌乙酸乙酯提取物轉(zhuǎn)移至西林瓶中，冷凍干燥后，作為酯層供試品。萃取后剩余水層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適宜體積，轉(zhuǎn)移至西林瓶，冷凍干燥，作為水層供試品。

精密稱量上述酯層和水層凍干粉末、供試單體化合物約2.0 mg，用50% DMSO 水溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1供試品溶液，待用。

2.2 DME探針檢測hCE1活性原理及操作步驟

DME 探針檢測hCE1 活性原理見圖1[20]。DME 探針經(jīng)hCE1水解后為生成螢火蟲熒光素酶的底物，可基于單位時(shí)間產(chǎn)物的相對光單位（RLU）值確定hCE1 的活性。為確保反應(yīng)速率在線性范圍內(nèi)，所使用的孵育時(shí)間、HLM質(zhì)量濃度及探針濃度根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。評估樣品對hCE1活力影響的體外孵化系統(tǒng)（總體積100 μL）包含HLM（200 μg·mL-1，終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1）5 μL、磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol·mL-1，pH 6.5）91 μL、DME（150 μmol·L-1，終濃度為3 μmol·L-1）及1.0 mg·mL-1的供試品溶液（終質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1）2 μL。

圖1 DME化學(xué)發(fā)光探針法檢測hCE1活性機(jī)制

取HLM、PBS和供試樣品溶液加入離心管后在渦旋儀上振蕩混勻，離心管置于37 ℃金屬浴振蕩預(yù)孵10 min，加入DME 溶液2 μL，繼續(xù)振蕩孵育10 min后，取反應(yīng)液50 μL加入裝有LDR 50 μL的白色不透明標(biāo)準(zhǔn)96 孔板。同時(shí)設(shè)置相關(guān)對照組，空白對照組不加入酶液，用等體積PBS 溶液代替，作為本底熒光；陰性對照組不加入供試樣品，用等體積50%DMSO 水溶液代替，作為酶活性100%對照。隨后采用全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分析，利用動(dòng)力學(xué)方法檢測。檢測30 min 后取出96 孔板。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

2.3 hCE1酶活力的計(jì)算

通過測定探針底物代謝產(chǎn)物的RLU 值來確定酶活力（Eres）。由公式（1）計(jì)算藥物作用下的Eres。

式中，C0為空白對照組孵育反應(yīng)后代謝產(chǎn)物RLU 生成量，C1為陰性對照組孵育反應(yīng)后代謝產(chǎn)物RLU 生成量，Ci為給藥組孵育反應(yīng)后代謝產(chǎn)物RLU生成量。

采用GraphPad Prism version 8.0.2 軟件擬合Eres，測定20 min 時(shí)酶活力趨于穩(wěn)定，對該時(shí)間點(diǎn)RLU 值進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示。選取hCE1 酶活力在20%以下的藥材或單體，稀釋后進(jìn)一步考察終質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1時(shí)對hCE1的抑制效果。

3 結(jié)果

3.1 中藥提取物對人肝微粒體hCE1酶活力的影響

提取物質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1時(shí)，hCE1 的酶活力＜20%的有綠茶酯層、女貞子水層、干姜酯層、胡椒水層、決明子水層、紅花酯層、決明子酯層、柴胡水層、制何首烏水層、胡椒酯層、蒲黃酯層。對酶活力＜20%的樣品稀釋10 倍后測定，結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1時(shí)，其中綠茶酯層、蒲黃酯層、決明子水層hCE1 酶活力分別為19.34%、29.99%和30.41%，即使在低質(zhì)量濃度下也表現(xiàn)出較好的hCE1抑制作用（表1）。

表1 18種中藥提取物體外對hCE1活力的影響（±s,n=3）

表1 18種中藥提取物體外對hCE1活力的影響（±s,n=3）

3.2 中藥來源活性單體對hCE1酶活力的影響

單體質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1時(shí)，hCE 酶活性＜20%的有甘草次酸。進(jìn)一步稀釋后，其質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1時(shí)hCE1酶活力為31.24%（表2）。

表2 12個(gè)中藥來源活性單體不同質(zhì)量濃度下體外對hCE1酶活力的影響（±s,n=3）

表2 12個(gè)中藥來源活性單體不同質(zhì)量濃度下體外對hCE1酶活力的影響（±s,n=3）

4 討論與結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，綠茶酯層、女貞子水層、干姜酯層、甘草次酸、胡椒水層、決明子水層、紅花酯層、決明子酯層、柴胡水層、制何首烏水層、胡椒酯層、蒲黃酯層等對hCE1 抑制效果較好。綠茶中的茶多酚、女貞子中的三萜類、干姜中的多酚類、胡椒中的胡椒堿、決明子中的蒽醌類、紅花中的黃酮類、柴胡中的三萜皂苷類、首烏中的蒽醌類和二苯乙烯類、蒲黃中的黃酮類可能是抑制hCE1活性的主要成分，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)血脂作用[15]。活性單體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘草次酸顯示出較強(qiáng)的活性。甘草次酸屬五環(huán)三萜類化合物，是甘草的主要有效成分，相關(guān)研究通過構(gòu)效關(guān)系分析表明，三萜類化合物廣泛存在hCE1 抑制活性，并可進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)修飾成為高選擇性和高效的hCE1 抑制劑[21]。本研究中其他單體的活性并不顯著，這也說明中藥對hCE1的抑制作用較復(fù)雜，還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究考察了18個(gè)調(diào)血脂類中藥及12個(gè)中藥單體在體外對hCE1 活性的抑制作用。綠茶、女貞子、干姜、甘草、胡椒、決明子、紅花、柴胡、制何首烏、蒲黃中的化學(xué)成分對hCE1 有較強(qiáng)的抑制作用。需要注意的是，服用這些藥物或食物時(shí)（如飲茶），除了調(diào)血脂外，其羧酸酯酶抑制作用會(huì)影響hCE1參與代謝的藥物的血藥濃度及藥效，如洛伐他汀、非諾貝特、氯吡格雷等[2,13]。