劉云寬，高敏，林柳任，張昆，蔡俊飛，馬云淑，3*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；

2.昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650500；

3.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室，云南 昆明 650500

高血壓是一種常見的慢性病，同時也是引發(fā)心血管病的最主要危險因素，控制高血壓是預(yù)防心血管疾病的關(guān)鍵措施[1]。目前，高血壓治療以藥物治療為主，如使用鈣拮抗劑、利尿劑、β受體阻斷劑等，但這些藥物普遍存在不良反應(yīng)較多、作用時間短、需終身服用等缺點[2-3]。六味地黃方是我國中醫(yī)滋陰補腎的經(jīng)典名方，至今已有近千年的應(yīng)用歷史。近期臨床研究發(fā)現(xiàn)，其能顯著改善高血壓患者的收縮壓和舒張壓[4]，對老年性高血壓、女性更年期高血壓、糖尿病合并高血壓及高血壓早期腎損傷均有良好的治療效果[5-8]，其與臨床常用的治療高血壓的化學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用時顯示出更優(yōu)的治療作用[9]。但六味地黃丸治療高血壓的分子作用機(jī)制尚未明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，收集六味地黃丸有效化合物及預(yù)測其治療高血壓的可能作用靶點，并通過富集分析揭示其治療高血壓的可能分子機(jī)制，為六味地黃丸治療高血壓的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 六味地黃丸有效化合物的收集與作用靶點的預(yù)測

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中，以“熟地黃”“山藥”“山茱萸”“茯苓”“澤瀉”“牡丹皮”作為檢索詞收集其化合物，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18篩選出有效化合物[10-11]，記錄化合物的MOL號，并將下載的MOL結(jié)構(gòu)輸入PharmMapper平臺（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預(yù)測作用靶點，篩選矯正分?jǐn)?shù)（Norm Fit）≥0.7 的靶點，用STRING v11.0 平 臺（https://string-db.org/）矯 正基因名。

1.2 六味地黃丸對高血壓作用靶點的預(yù)測

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中（https://www.genecards.org/）以“hypertension”檢索高血壓相關(guān)靶點，選擇相關(guān)度得分≥20 的靶點作為高血壓靶點，并與六味地黃丸的預(yù)測靶點一同輸入Venny 2.1平臺，得的共同靶點即為六味地黃丸對高血壓的作用靶點，通過Cytoscape 3.6.1軟件建立化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 六味地黃丸作用于高血壓靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點輸入STRING v11.0 平臺得到靶點的相互聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)一步構(gòu)建其PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 六味地黃丸作用于高血壓靶點的基因本體（GO）富集與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

在DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中導(dǎo)入共有靶點，從生物過程、細(xì)胞成分和分析功能進(jìn)行GO 富集分析，使用GraphPad Prism 7 軟件將P＜0.05 的結(jié)果可視化；以KEGG 進(jìn)行通路分析，用R 語言將P＜0.05 的結(jié)果生成可視化氣泡圖。

1.5 分子對接驗證

使用AutoDock 軟件對六味地黃丸中的成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行分子對接驗證，并通過所得的binding-energy 得分評價化學(xué)成分與靶點間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸有效化合物

由1.1 項下的檢索方法，得到熟地黃有效化合物2 個，山藥有效化合物16 個，山茱萸有效化合物20個，茯苓有效化合物15個，澤瀉有效化合物10個，牡丹皮有效化合物11 個，見表1。除去藥材間重復(fù)化合物，得到六味地黃丸有效化合物共69 個，共預(yù)測并校正得到5495 個靶點的標(biāo)準(zhǔn)基因名，刪除重復(fù)靶點后剩余269個靶點。

表1 六味地黃丸有效化合物

續(xù)表1

2.2 六味地黃丸對高血壓的作用靶點

GeneCards 數(shù)據(jù)庫共檢索出7913 個高血壓相關(guān)靶點，相關(guān)度得分≥20 的靶點有176 個。通過Venny 2.1 平臺交互六味地黃丸與高血壓的靶點，得到六味地黃丸作用于高血壓的靶點共14 個，見表2。將藥材與其有效化合物相聯(lián)系，共得到74 對相關(guān)的聯(lián)系；將每個化合物和其作用于高血壓的靶點相聯(lián)系，共得到545 對相關(guān)的聯(lián)系，通過Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。結(jié)果表明，六味地黃丸治療高血壓的主要成分是茯苓酸、澤瀉醇、芍藥苷、谷甾醇、豆甾醇等。

圖1 六味地黃丸作用于高血壓的藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

表2 六味地黃丸作用于高血壓的靶點

2.3 六味地黃丸對高血壓作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將14 個共有靶點導(dǎo)入STRING v11.0 數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置靶點之間最低要求的聯(lián)系分?jǐn)?shù)為0.4，將結(jié)果輸入Cytoscape 3.6.1 得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)中有14 個節(jié)點、35 條邊，血清白蛋白（ALB）、一氧化氮合酶3（NOS3）、表皮生長因子受體（EGFR）、腎素（REN）是其主要的作用靶點。

圖2 六味地黃丸對高血壓作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 六味地黃丸作用于高血壓靶點的GO 富集與KEGG通路分析

將共有靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，GO 富集分析結(jié)果體現(xiàn)在生物過程（BC）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）3 方面，在P＜0.05 條件下，這3 個方面分別得到35、7、11 個條目，取前10 個條目用GraphPad Prism 7 軟件作成可視化條形圖，見圖3。KEGG 通路富集分析得到6 條通路（P＜0.05），分別是黏附連接（adherens junction）、胰腺癌（pancreaticcancer）、破骨細(xì)胞分化（osteoclast differentiation）、FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）、癌癥途徑（pathways in cancer）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）。黏附連接通路由4個基因靶點共同調(diào)控，分別是轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅰ（TGFBR1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ（TGFBR2）、表皮生長因子受體（EGFR）、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1（PTPN1）；胰腺癌通路由3 個基因靶點共同調(diào)控，分別是TGFBR1、TGFBR2、EGFR；破骨細(xì)胞分化通路由3 個基因靶點共同調(diào)控，分別是TGFBR1、TGFBR2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）；FoxO信號通路由3個基因靶點共同調(diào)控，分別是TGFBR1、TGFBR2、EGFR；癌癥途徑通路由4 個基因靶點共同調(diào)控，分別是TGFBR1、TGFBR2、PPARG、EGFR；RAS 通路由2 個基因靶點共同調(diào)控，分別是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）、REN，將分析結(jié)果用R 語言生成可視化氣泡圖，見圖4。

圖3 六味地黃丸對高血壓作用靶點的GO富集分析

圖4 六味地黃丸對高血壓作用靶點的KEGG分析

2.5 分子對接驗證

采用AutoDock 軟件對藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)度值排名前10 位的化合物與PPI 網(wǎng)絡(luò)中自由度較高的前4 個靶點進(jìn)行分子對接。通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載ALB、NOS3、EGFR、REN 的PDB 文件，于PyMOL 軟件移除水分子和配體分子，AutoDock 軟件分別對接靶點與化合物，最后將對接好的PDBQT文件導(dǎo)入PyMOL軟件中，顯示化合物和靶點相結(jié)合的位點圖。分子對接結(jié)果中，蛋白質(zhì)與化合物結(jié)合越緊密，結(jié)合能（binding energy）值越低，見表3。結(jié)合較緊密的前5 組分子對接見圖5。

圖5 六味地黃丸中作用于高血壓的化合物與核心靶點的分子對接

表3 六味地黃丸作用于高血壓的化合物-靶點分子對接

3 討論

高血壓的臨床癥狀表現(xiàn)為頭痛頭暈、疲勞心悸、頸項板緊等，在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中可歸屬于“眩暈”“頭痛”“中風(fēng)”等范疇，常見于中老年人，在年輕人中發(fā)病較少。黃興等[12]認(rèn)為，中老年人高血壓因體內(nèi)的腎氣虧虛、臟腑功能失調(diào)而致，在治療中應(yīng)重視補腎臟、調(diào)陰陽。六味地黃丸是滋陰補腎的經(jīng)典名方，對高血壓有明顯改善、治療作用[13-14]，相關(guān)分子機(jī)制仍需不斷探索。

本研究結(jié)果顯示，六味地黃丸的69 個有效化合物可作用于14 個高血壓靶點。茯苓酸B 作用于高血壓的靶點數(shù)最多（12 個），5-{[5-(4-methoxyphenyl)-2-furyl]methylene}barbituric acid 作用于高血壓的靶點數(shù)最少（2 個），說明六味地黃丸治療高血壓時確實存在多成分、多靶點的特點。alisol，b，23-acetate 及茯苓酸B 能抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的RAS/Wnt/βcatenin 軸的激活，減輕人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK-2 和足細(xì)胞的損傷，其中血管緊張素Ⅱ激活RAS，能引起高血壓、慢性腎臟病發(fā)生[15]；槲皮素、山柰酚、豆甾醇具有抗低密度脂蛋白氧化和抗血小板聚集作用，具有保護(hù)心血管的活性[16]。

六味地黃丸作用于高血壓14 個靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，每個靶點與其他靶點聯(lián)系的個數(shù)依次是ALB（12 個）、NOS3（9 個）、EGFR（8 個）、REN（7個）、F2（5個）、PPARG（5個）、TGFBR1（4個）、PTPN1（4 個）、ACE2（4 個）、NR3C2（4 個）、SELP（3 個）、TGFBR2（2 個）、TTR（2 個）、GBA（1個），其中靶蛋白ALB、NOS3、EGFR、REN 在蛋白相互作用網(wǎng)的度值較高，說明六味地黃丸可能通過以上靶點治療高血壓。王建國[17]報道高血壓性腦出血患者的血腫周圍的水腫程度與ALB 水平呈負(fù)相關(guān)，ALB 能通過調(diào)節(jié)凝血功能、降低炎癥因子毒性、保護(hù)大腦微循環(huán)的途徑改善腦功能；NOS3是心血管系統(tǒng)中重要的氧化應(yīng)激相關(guān)因子，能雙重調(diào)節(jié)血壓，NOS3 可產(chǎn)生NO 來舒張血管從而降低血壓，也能產(chǎn)生超氧陰離子后繼而氧化成亞硝酸鹽，起到促高血壓作用[18]；EGFR 可以調(diào)節(jié)血管張力和組織的平衡，也可以參與誘導(dǎo)促炎介質(zhì)生成，增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞的增殖及血管重構(gòu)，從而加劇高血壓等血管疾病的發(fā)展[19]。

GO 富集分析結(jié)果顯示，六味地黃丸治療高血壓的相關(guān)生物過程有活性氧代謝過程的調(diào)控、對雌激素的反應(yīng)、血壓調(diào)節(jié)、傷口愈合、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、基因表達(dá)調(diào)控、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）參與心內(nèi)膜墊形成的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖調(diào)控、血小板活化的負(fù)調(diào)節(jié)等。Yeasmin 等[20]報道，絕經(jīng)后婦女的高血壓與血清中雌激素水平有關(guān)，血清雌激素水平與收縮壓和舒張壓水平呈負(fù)相關(guān)。在血管損傷方面有關(guān)鍵作用的是氧化應(yīng)激，高血壓人群體內(nèi)的活性氧生成明顯增多，抗氧化治療能減小血管損傷、降低高血壓導(dǎo)致的終末器官損傷[21]。高血壓能引起腎臟并發(fā)癥，如腎纖維化，而EMT 在腎纖維化過程中起重要作用，抑制EMT 能改善高血壓對腎的損傷[22]。有高血壓病史的患者體內(nèi)低密度脂蛋白膽固醇增高會引起腦梗死，但過低會增加腦出血風(fēng)險[23]。心房顫動（AF）是較為常見的心律失常，能引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥而危及生命，其中高血壓患者血清中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶升高和左房內(nèi)徑擴(kuò)大增加了AF的發(fā)生，注重高血壓患者血清血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水平與左房內(nèi)徑能預(yù)防AF發(fā)生[24]。

KEGG 通路富集結(jié)果顯示，六味地黃丸靶點富集的高血壓相關(guān)通路有黏附連接、胰腺癌、破骨細(xì)胞分化、FoxO 信號通路、癌癥途徑、RAS。原發(fā)性高血壓（EH）能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，這會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及內(nèi)皮損傷[25]。李小兵等[26]報道可溶性細(xì)胞間黏附分子（sICAM1）、可溶性血管細(xì)胞黏附分子（sVCAM1）在痰濕證原發(fā)性高血壓患者中顯著升高；平靜娜等[27]報道，代謝綜合征及其包括的新發(fā)糖尿病、體質(zhì)量指數(shù)增高、高血壓等代謝性疾病都是胰腺癌發(fā)生的危險因素；高血壓患者中骨質(zhì)疏松的發(fā)病率遠(yuǎn)高于正常人，可能是因為高血壓引起機(jī)體某些激素水平變化，而導(dǎo)致老年人骨形成率降低，但破骨細(xì)胞分化、成熟和骨吸收活性相對活躍，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，預(yù)防骨質(zhì)疏松能減少及延緩高血壓對靶器官的損害[28]。氧化應(yīng)激反應(yīng)通過PI3K/FoxO 信號通路傳導(dǎo)及表達(dá)相關(guān)的酶和蛋白，從而引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致血栓形成[29]。惡性腫瘤和高血壓都屬于增殖性病變，高血壓引起的血流動力學(xué)的改變及易栓塞傾向能加快腫瘤的發(fā)展，推動腫瘤的進(jìn)程[30]。RAS屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)，在機(jī)體中維持水電解質(zhì)平衡、血壓穩(wěn)定、心血管系統(tǒng)穩(wěn)定，抑制RAS 的過度激活能穩(wěn)定調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞內(nèi)水-鈉平衡及心血管微環(huán)境，從而控制血壓[31]。這些均與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的生物功能注釋和通路分析一致。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法揭示了六味地黃丸治療高血壓時存在的可能分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，六味地黃丸通過多活性成分、多靶點、多途徑發(fā)揮抗高血壓作用，為該制劑的進(jìn)一步藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析和機(jī)制研究提供參考。