李依林,薛雪,王海麗,韓婷,劉夢楠,魏鋒,李向日*
1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,北京 102488;
2.中藥品質(zhì)中心北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102488;
3.中國食品藥品檢定研究院,北京 100050
防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,味辛、甘,性微溫,歸膀胱、肝脾經(jīng),具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效,主要用于治療感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)[1]。其主要含有揮發(fā)油類、香豆素類、色原酮類等成分,色原酮類成分是其發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ),具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板聚集等作用[2]。
目前市場上流通的防風(fēng)根據(jù)其生長方式大致分為3類,即野生防風(fēng)、多年生栽培防風(fēng)和1年生栽培防風(fēng)。野生防風(fēng)是自然界中自然生長的防風(fēng),在我國主產(chǎn)于黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古等地,在其他國家主要分布于蒙古國、俄羅斯等地。由于其在生長過程中沒有人為干預(yù),一般為3 年以上生,產(chǎn)量較低。栽培防風(fēng)主產(chǎn)于我國內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等地。由于黑龍江、內(nèi)蒙古等地區(qū)氣候寒冷,既有1 年生防風(fēng)也有多年生防風(fēng),而河北安國等地防風(fēng)栽培第二年出現(xiàn)抽薹,嚴(yán)重影響產(chǎn)量,因此所產(chǎn)均為1 年生防風(fēng)。多年生栽培防風(fēng)采用種子直播并選擇粗放的方式管理,生長過程中沒有人為干預(yù),不施肥、不噴農(nóng)藥,多為2~6年生;1年生栽培防風(fēng)僅生長1 年,且在種植過程中通過施肥、噴灑農(nóng)藥等進(jìn)行人為干預(yù)。由于生長方式的不同,防風(fēng)之間的質(zhì)量差異也較大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),僅野生防風(fēng)符合《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版中對(duì)防風(fēng)外觀性狀的規(guī)定,栽培品均不符合該規(guī)定,即《中國藥典》2020 年版中并未收載栽培防風(fēng)飲片的性狀。然而,由于野生防風(fēng)資源匱乏,現(xiàn)今在市場流通的主要是栽培品。作為1 味臨床常用中藥,防風(fēng)質(zhì)量直接影響到其臨床療效,栽培防風(fēng)能否納入《中國藥典》值得研究[2-3]。
本研究對(duì)54 批不同生長方式防風(fēng)的高效液相色譜法(HPLC)圖譜進(jìn)行研究,得到野生、多年生栽培品及1 年生栽培品的特征圖譜,并通過特征圖譜對(duì)其生長方式進(jìn)行區(qū)分??寡鬃饔檬欠里L(fēng)的主要藥理作用之一,研究表明,防風(fēng)可以通過抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 釋放一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子來發(fā)揮抗炎作用[4]。本研究采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子,對(duì)3 種生長方式防風(fēng)體外抗炎作用效果進(jìn)行比較,為防風(fēng)質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考,推動(dòng)防風(fēng)更好地用于臨床疾病的治療。
FW100 型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);BT 125D 型電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);B-220 型電熱恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);Waters 2695 型高效液相色譜儀;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);SARTORIUS AG 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);SPECTRO star Nano 型全波長酶標(biāo)儀(BMG Labtech 公司);Form 311 型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)。
共收集防風(fēng)樣品54 批(表1),產(chǎn)地分布于蒙古國、俄羅斯、中國黑龍江省、中國內(nèi)蒙古自治區(qū)等地,分別為野生品12 批、多年生(2~6 年)栽培品16 批、1 年生栽培品26 批,其中3~12 號(hào)樣品為防風(fēng)飲片(批號(hào)分別為FF-YP-HM-15、FF-YP-HM-16、FF-YP-HM-17、FF-YP-HM-18、FF-YP-HM-19、FFYP-HM-20、FF-YP-HM-21、FF-YP-HM-22、FF-YPHM-23、FF-YP-HM-24),其余樣品采集時(shí)為防風(fēng)藥材,前期已按照《中國藥典》2015年版(四部)炮制通則項(xiàng)下凈制和切制的方法炮制成飲片,3種防風(fēng)飲片外觀性狀見圖1。樣品均為課題組人員親自采集,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。
表1 防風(fēng)樣品信息
圖1 不同生長方式及生長年限防風(fēng)飲片的外觀性狀
小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 購于北京協(xié)和細(xì)胞庫。
對(duì)照品升麻素苷(批號(hào):0083-0025)、升麻素(批號(hào):0084-0020)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào):0081-0025)、亥茅酚苷(批號(hào):0969-0025)均購自成都普思生物科技股份有限公司,純度均大于98.0%;防風(fēng)對(duì)照藥材(批號(hào):120947-201409)購自中國食品藥品檢定研究院;LPS(Sigma 公司);噻唑藍(lán)(MTT,Amresco 公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA 檢測試劑盒(Cloud-Clone 公司);NO 檢測試劑盒(BioDee 公司);胎牛血清(Gemini公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(Corning-Cellgro公司);青鏈霉素(Mediatech公司);二甲基亞砜(DMSO,Sigma公司);甲醇(色譜純,F(xiàn)isher公司);娃哈哈純凈水。
2.1.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長為254 nm,流速為1.0 mL·min-1,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B),梯度洗脫(0~5 min,15%~35%A;5~15 min,35%A;15~20 min,35%~45%A;20~29 min,45%A;29~35 min,45%~55%A;35~41 min,55%~65%A;41~55 min,65%~76%A;55~65 min,76%A,65~70 min,76%~83%A)。
2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定防風(fēng)樣品細(xì)粉約0.25 g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,稱定質(zhì)量,水浴回流2 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。
2.1.3 對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液制備 精密稱定防風(fēng)對(duì)照藥材約0.25 g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,稱定質(zhì)量,水浴回流2 h,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,作為對(duì)照藥材溶液。取對(duì)照品升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷各適量,加甲醇分別配制成質(zhì)量濃度分別為0.320、0.120、0.280、0.033 mg·mL-1的溶液,作為對(duì)照品溶液。
2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(13號(hào)),重復(fù)進(jìn)樣6次,所測7個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD均小于2%,符合要求,表明儀器精密度良好。
2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(13號(hào)),分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測定,所測7 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于2%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品細(xì)粉6份(44號(hào)),按2.1.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測定,所測7 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于3%,表明方法重復(fù)性良好。
2.1.7 樣品測定 按2.1.1 項(xiàng)下方法分別精密吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液與供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,記錄54批防風(fēng)的HPLC色譜圖。
2.2.1 水提物的制備 分別稱取野生防風(fēng)飲片(3號(hào))、多年生栽培防風(fēng)飲片(24號(hào))、1年生防風(fēng)飲片(53號(hào))各約5 g,分別置于圓底燒瓶中,加入水75 mL 回流2 h,濾過,取續(xù)濾液。濾渣再加入水75 mL 回流1 h,濾過,合并2次濾液,旋蒸干燥,得到水提物,提取率分別為21.40%、43.88%、44.66%。3 種水提物中升麻素苷、升麻素5-O-甲基維斯阿米醇苷以及亥茅酚苷4 種色原酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和分別為4.22%、1.47%、0.92%。3 種水提物各精密稱定約1 g,用DMSO溶解后,用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋(DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.3%,對(duì)細(xì)胞無毒性作用),得到含水提物250 μg·mL-1的DMEM培養(yǎng)基。
2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基,于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),隔天傳代。
2.2.3 MTT 法檢測3 種防風(fēng)水提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL,接種于96 孔板,每孔100 μL,置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。對(duì)照組吸取上清液后每孔加入DMEM 完全培養(yǎng)基100 μL;各藥物組的上清液分別換為含3 種不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培養(yǎng)基100 μL。每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔,在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后吸取上清液,每孔加入MTT 溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液,每孔加入DMSO 150 μL,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上于490 nm檢測吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,按照公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率[5]。
2.2.4 3種防風(fēng)水提物對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO、TNF-α釋放的影響 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,接種于24 孔板,每孔500 μL,置于含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。細(xì)胞貼壁后,棄上清液,用含3種不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培養(yǎng)基和含1 μg·mL-1LPS的DMEM 完全培養(yǎng)基處理,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組(LPS 組)、野生組、多年生栽培組、1 年生栽培組。各藥物組的給藥方式為先加入對(duì)應(yīng)的含藥培養(yǎng)基500 μL,預(yù)處理1 h 后,吸去含藥培養(yǎng)基,加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基500 μL,孵育24 h;模型組加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培養(yǎng)基500 μL,孵育24 h;對(duì)照組直接加入DMEM完全培養(yǎng)基500 μL,孵育24 h。每組3 個(gè)復(fù)孔。孵育結(jié)束后,收集上清液,利用試劑盒檢測上清液中NO、TNF-α水平。
數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,使用箱式圖對(duì)各組內(nèi)升麻素相對(duì)峰面積進(jìn)行分析,剔除離群值;特征峰相對(duì)峰面積及RAW264.7 細(xì)胞NO、TNF-α釋放的組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)。采用SIMCA 13.0 對(duì)3 種防風(fēng)飲片特征圖譜中特征峰相對(duì)峰面積進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)。
3.1.1 3 種生長方式防風(fēng)特征圖譜的建立 通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012 版)生成不同生長方式及年限防風(fēng)飲片的對(duì)照特征圖譜(圖2)。54 批樣品特征圖譜存在1、3、4~7 共6 個(gè)共有峰。此外,2 號(hào)峰為升麻素,其在非野生品中含量很小,有些批次甚至含量為0,而升麻素為防風(fēng)的主要藥效成分及入血成分,也是區(qū)分防風(fēng)生長方式的重要指標(biāo)[6],與防風(fēng)飲片的質(zhì)量密切相關(guān),故將2號(hào)峰與其他6個(gè)共有峰共列為特征峰。
圖2 防風(fēng)飲片HPLC特征圖譜
3.1.2 不同生長方式防風(fēng)特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 供試品色譜圖中與對(duì)照特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間范圍內(nèi)一致的7 個(gè)特征峰,以5-O-甲基維斯阿米醇苷為參照峰,將其保留時(shí)間和峰面積均定義為1,計(jì)算54 批防風(fēng)飲片特征峰的相對(duì)保留時(shí)間(表2)和相對(duì)峰面積(表3)。比較3 種不同生長方式防風(fēng)7個(gè)特征峰相對(duì)峰面積,野生防風(fēng)1、2、4、6號(hào)峰相對(duì)峰面積與多年生栽培防風(fēng)和1年生栽培防風(fēng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,多年生栽培防風(fēng)1、5號(hào)峰的相對(duì)峰面積與1年生栽培防風(fēng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。
表2 防風(fēng)飲片7個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間
表3 防風(fēng)飲片7個(gè)特征峰相對(duì)峰面積
3.2.1 野生防風(fēng)與栽培防風(fēng)的區(qū)別 SPSS 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,編號(hào)為13、17、18 的3 個(gè)樣品為異常值(圖3)。通過SPSS非參數(shù)檢驗(yàn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),2個(gè)異常值17、18 剔除前后野生防風(fēng)飲片與多年生栽培、1年生栽培防風(fēng)飲片中的2號(hào)峰(升麻素)的相對(duì)峰面積差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果未發(fā)生變化,故剔除2個(gè)異常值。剔除后野生防風(fēng)飲片中2號(hào)峰相對(duì)峰面積極小值為0.15,多年生栽培、1年生栽培防風(fēng)飲片中2號(hào)峰相對(duì)峰面積極大值為0.09。
圖3 升麻素相對(duì)峰面積箱形圖
3.2.2 多年生與1 年生栽培防風(fēng)特征圖譜的區(qū)別對(duì)多年生栽培與1年生栽培防風(fēng)特征圖譜的7個(gè)特征峰相對(duì)峰面積及不同相對(duì)峰面積的和進(jìn)行PLS-DA,結(jié)果見圖4 和表4。由圖4 可知,42 批栽培防風(fēng)中,除個(gè)別批次樣品外,1年生栽培防風(fēng)與多年生栽培防風(fēng)基本可以分別聚為1類,表明其特征圖譜相對(duì)峰面積具有差異。然而在所建立的PLS-DA模型中,累計(jì)解釋能力參數(shù)R2X和R2Y分別為0.637和0.479,預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.312,提示所建立的模型穩(wěn)定性及預(yù)測能力較差,可能是由于2種栽培防風(fēng)組內(nèi)差異較大所致。
表4 3種不同生長方式防風(fēng)特征圖譜相對(duì)峰面積(±s)
表4 3種不同生長方式防風(fēng)特征圖譜相對(duì)峰面積(±s)
注:與野生組比較,***P<0.001;與多年生栽培組比較,##P<0.01。
圖4 栽培防風(fēng)飲片PLS-DA得分
MTT 法檢測結(jié)果顯示,250 μg·mL-1時(shí)3 種提取物在24 h內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長無明顯影響。3種防風(fēng)對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO 和TNF-α釋放的影響結(jié)果見圖5~6。與對(duì)照組比較,LPS 刺激顯著增加RAW264.7 細(xì)胞中NO、TNF-α的產(chǎn)生。與LPS 模型組比較,3 種防風(fēng)的提取物均顯著抑制了細(xì)胞中NO、TNF-α的產(chǎn)生。野生防風(fēng)提取物對(duì)NO和TNF-α產(chǎn)生的抑制作用最強(qiáng)。結(jié)果表明,防風(fēng)提取物在體外均表現(xiàn)出抗炎作用,作用強(qiáng)度為野生組>多年生栽培組>1 年生栽培組,野生組與多年生組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而1 年生組作用與野生組和多年生栽培組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖5 3種防風(fēng)水提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響(±s,n=3)
圖6 3種防風(fēng)水提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞TNF-α釋放量的影響(±s,n=3)
本研究采用梯度洗脫法分離防風(fēng)中的成分,分離效果良好;通過二極管陣列(DAD)檢測器全波長掃描得到在254 nm波長下吸收最高,故選擇254 nm作為檢測波長。流動(dòng)相比較了甲醇-0.5%乙酸水系統(tǒng)與甲醇-水系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)甲醇-水梯度洗脫基線更加穩(wěn)定且分離效果更好[7]。對(duì)防風(fēng)的提取時(shí)間進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)提取2 h 為最佳提取條件。在對(duì)HPLC 圖譜的分析中發(fā)現(xiàn),使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2012 版并不能對(duì)3 種不同生長方式的方法進(jìn)行有效區(qū)分,因此,分別生成3 種不同生長方式防風(fēng)的特征圖譜后進(jìn)行分析。對(duì)3 種防風(fēng)的特征圖譜進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),野生防風(fēng)的多個(gè)特征峰相對(duì)峰面積與栽培防風(fēng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,通過2 號(hào)峰即升麻素的相對(duì)峰面積就能夠?qū)σ吧里L(fēng)與栽培防風(fēng)進(jìn)行區(qū)分。多年生栽培防風(fēng)與1 年生栽培防風(fēng)在相對(duì)峰面積上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在PLS-DA 中顯示出2 種防風(fēng)的差異。但同時(shí)多年生防風(fēng)樣品也表現(xiàn)出較大的組間差異,尤其是多年生栽培防風(fēng)由于樣品數(shù)量較少且產(chǎn)地與生長年限差別較大,如17、28 號(hào)等樣品與其他樣品間差異過大,對(duì)于多年生栽培防風(fēng)的聚類影響較大。對(duì)栽培防風(fēng)的特征圖譜進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地對(duì)其的影響有待進(jìn)一步研究。
本研究對(duì)采集的54 批不同生長方式防風(fēng)進(jìn)行了特征圖譜研究,得到了野生、多年生栽培、1 年生栽培3 種不同生長方式防風(fēng)的特征圖譜,同時(shí)證實(shí)了升麻素含量是野生品與栽培品的主要區(qū)別指標(biāo),通過相對(duì)保留時(shí)間找到特征峰,再根據(jù)升麻素的相對(duì)峰面積可以準(zhǔn)確區(qū)分野生品與栽培品。
NO 和TNF-α是體內(nèi)重要的炎癥因子,能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)[8]。對(duì)不同生長方式防風(fēng)體外抗炎作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),3 種不同生長方式的防風(fēng)在體外均可通過抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌NO 和TNF-α發(fā)揮抗炎作用,其中野生防風(fēng)和多年生栽培防風(fēng)均有顯著抑制2種炎癥因子的作用,且2種防風(fēng)作用效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而1年生栽培防風(fēng)對(duì)2種炎癥因子的抑制效果不及前2 種防風(fēng),且與野生防風(fēng)和多年生防風(fēng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即野生防風(fēng)與多年生栽培防風(fēng)抗炎作用效果相近且顯著優(yōu)于1 年生栽培防風(fēng)。
本研究中多年生防風(fēng)和1 年生防風(fēng)在特征圖譜上的區(qū)分不夠明顯,但在體外抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果上區(qū)分明顯,進(jìn)一步說明防風(fēng)的抗炎作用不僅與上述色原酮類成分有關(guān),還可能與揮發(fā)油等成分有關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果顯示,多年生防風(fēng)不僅外觀性狀接近野生防風(fēng),揮發(fā)油和色原酮等主要有效成分含量也與野生防風(fēng)更加接近,而1 年生栽培防風(fēng)在外觀性狀上與野生防風(fēng)相去甚遠(yuǎn),且整體成分組成與傳統(tǒng)防風(fēng)差異較大,與本實(shí)驗(yàn)中不同生長方式防風(fēng)體外抗炎實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。
防風(fēng)作為一味臨床常用中藥,野生資源匱乏,現(xiàn)如今市場流通多為栽培品,質(zhì)量參差不齊,1 年生防風(fēng)充斥市場。因此,建議將多年生栽培防風(fēng)納入《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn),并結(jié)合科學(xué)可靠的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)使防風(fēng)能夠更好地用于臨床疾病的治療。