張平，黃聰琳，王曉琳，馬瀟*，楊平榮，鄭健

1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；

2.甘肅省中藏藥檢驗檢測技術(shù)工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；

3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；

4.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

苦水玫瑰Rosa rugose‘Kushui’屬薔薇科薔薇屬多年生常綠或落葉灌木，是中國玫瑰和鈍齒薔薇的雜交品種，因產(chǎn)地甘肅永登苦水鎮(zhèn)而得名，是一種具有藥食兩用價值的天然植物[1]。玫瑰花蕾低溫干燥用作玫瑰花茶，氣芳香濃郁，具有行氣解郁、消除疲勞、消炎殺菌、調(diào)節(jié)體質(zhì)、潤澤肌膚等功效?？嗨倒遄鳛樗幨硟捎玫闹参铮斜匾岣咂滟|(zhì)量標準，以保證使用上的準確和安全。

分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展為藥材鑒定提供了新的思路，DNA 條形碼技術(shù)的應(yīng)用有利于藥食兩用植物的準確鑒定。本研究按照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部附錄9107“中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導原則”[2]，對苦水玫瑰、平陰玫瑰R.rugosaThunb.、月季R.chinensisJacq.、金邊玫瑰R.Jinbian、法蘭西玫瑰R.gallicaL.的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）及ITS2 序列進行研究分析[3]，并以玫瑰對照藥材作為參照物，利用苦水玫瑰序列的差異性對其進行鑒別，以期從分子水平全面了解苦水玫瑰的序列特征，與其他玫瑰品種進行區(qū)分，為培育玫瑰花優(yōu)良品種提供參考。

1 材料

1.1 樣品與試劑

樣品采自中國甘肅、山東、云南及臺灣，由甘肅省藥品檢驗研究院馬瀟主任藥師鑒定，具體信息見表1。

表1 樣品信息

植物基因組DNA 提取試劑盒、2×TaqMaster Mix、定量Marker（北京天根生物技術(shù)有限公司）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 儀器

8000M 型高能量球磨機（美國Spex 公司）；Veriti型梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀、3730XL型測序儀（美國ABI 公司）；JY600C 型水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；ZF-388 型全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司）；MS205DU型十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；Pacific RO 型純水儀、Nano Value8000型多樣品-微量紫外分光光度計（賽默飛世爾公司）；Codon Code Aligner 3.7.1序列拼接軟件（美國Codon Code公司）。

2 方法

2.1 樣品總DNA的提取

稱取供試品20 mg，每個供試品平行取樣2 份，利用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA。微量紫外分光光度計測定DNA濃度。

2.2 PCR反應(yīng)擴增

ITS 序列擴增引物正向為ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向為ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；ITS2 序列擴增引物正向為ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向為ITS3R：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'。采用20 μL 反應(yīng)體系，包括DNA 模板3 μL（1 μL 約50 ng）、2×TaqMaster Mix 緩沖液10 μL、正反向引物各0.4 μL 及滅菌ddH2O 6.2 μL。陰性對照不加模板DNA，以滅菌ddH2O 補足體積。擴增程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

配制50×TAE緩沖液（稱取Na2EDTA·2H2O 37.2 g、Tris242g于1 L燒杯中，加入800 mL的去離子水，充分攪拌溶解。再加入冰醋酸57.1 mL，充分混勻。加去離子水定容至1 L，室溫保存），稀釋50 倍得到1×TAE 工作液。制備含顯色劑ExRed（1∶10 000）的1.5%瓊脂糖凝膠，放入水平電泳槽，添加1×電泳緩沖液至沒過膠板，瓊脂糖凝膠點樣槽內(nèi)加入擴增產(chǎn)物3 μL。設(shè)置電壓5 V·cm-1，進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約2 cm 處時，停止電泳。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

2.4 PCR擴增產(chǎn)物測序

對照DNA Marker，將電泳結(jié)果顯示相對分子質(zhì)量正確的單一明亮條帶的擴增產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。

2.5 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對拼接，去除引物區(qū)段，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法[4]，去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段，獲得ITS2 序列。將拼接好的序列于GenBank 上進行比對分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura-2-parameter，K2P）計算種內(nèi)及種間遺傳距離，進行barcoding gap分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于K2P 模型，采用臨接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用1000 次重復檢測的Bootstrap 值表示樹上各節(jié)點的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 電泳結(jié)果

取樣品提取DNA 片段，因受到色素等雜質(zhì)的影響，提取效果不理想，故將樣品分為花瓣和花梗分別粉碎取樣分析，結(jié)果表明，花梗類樣品提取的DNA 片段更佳，所受到的干擾小，故選擇用花梗粉末提取DNA 片段，擴增后電泳。為了數(shù)據(jù)準確性，平陰玫瑰、月季、金邊玫瑰、法蘭西玫瑰均提取了2 份DNA 片段進行電泳分析，玫瑰對照藥材因只有粉末故只提取了1 份，苦水玫瑰按表1 提取了7 份。玫瑰采集樣品與對照藥材ITS 和ITS2 序列的電泳結(jié)果見圖1～2，均顯示為單一條帶。ITS 和ITS2 圖中部分電泳點顏色較淺，可能是樣品間存在差異，或提取DNA片段時雜質(zhì)干擾使片段不純。

3.2 ITS序列測序結(jié)果

電泳檢測結(jié)果顯示，ITS引物的擴增產(chǎn)物片段大小接近750 bp（圖1），ITS2 引物的擴增產(chǎn)物片段大小接近500 bp（圖2）。ITS引物的擴增產(chǎn)物片段大于ITS2 引物，理論上ITS 引物的擴增產(chǎn)物攜帶更豐富堿基信息和鑒別位點，更適用于區(qū)分不同玫瑰品種。但是，測序結(jié)果顯示，ITS引物擴增產(chǎn)物中大部分樣品的測序結(jié)果雙峰嚴重，無法有效拼接（圖3），可用數(shù)據(jù)量低，含不確定性堿基比例高，因此無法根據(jù)ITS 序列對苦水玫瑰及參考物種進行序列比對與分析。

圖1 樣品ITS序列的PCR擴增電泳圖

圖2 ITS2序列的PCR擴增電泳圖

圖3 6號苦水玫瑰樣品ITS引物擴增產(chǎn)物的測序峰圖

3.3 ITS2序列分析

3.3.1 ITS2 變異位點分析 測序序列使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對拼接，去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段后，獲得的ITS2 序列位點信息見圖4～5。7 個苦水玫瑰樣品獲得了2 個ITS2 單倍型，分別為6 和8 序列，存在1 個變異位點?？嗨倒迮c其他樣品ITS2 序列長度均為213 bp，且物種序列相近?？嗨倒迮c玫瑰及玫瑰對照藥材存在1～2 個變異位點，與金邊玫瑰和法蘭西玫瑰存在2～3 個變異位點，主要變異區(qū)在156～208 bp，見表2。

表2 樣品ITS2變異位點分析

圖4 苦水玫瑰變異位點

3.3.2 ITS2 遺傳距離分析 苦水玫瑰6 與各物種間的平均遺傳距離為0.006 74，苦水玫瑰8 與各物種間的平均遺傳距離為0.011 58?？嗨倒宸N內(nèi)遺傳距離為0.004 80，苦水玫瑰與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離最遠，其中苦水玫瑰8 與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離達0.014 51?？嗨倒? 與玫瑰對照藥材、玫瑰和月季序列的遺傳距離最近，僅為0.004 81，接近苦水玫瑰的種內(nèi)遺傳距離，見表3。

表3 樣品ITS2遺傳距離分析

圖5 苦水玫瑰與其他物種比較的變異位點

3.3.3 ITS2序列NJ樹聚類分析 利用MEGA 5.0軟件對苦水玫瑰樣品的ITS2 序列分析比對，鄰接法進行聚類分析。聚類分析結(jié)果顯示，不同種有明顯區(qū)分，不同物種各聚為1 支，其中玫瑰和玫瑰對照藥材的遺傳距離相對接近，聚為1支。而2條苦水玫瑰序列種內(nèi)存在1 個變異位點，使其分為2 個單支，見圖6。

圖6 基于ITS2序列構(gòu)建的不同品種玫瑰的NJ系統(tǒng)聚類樹

4 討論與結(jié)論

被子植物的ITS 序列長度通常為600～700 bp，在具有高度保守性和穩(wěn)定性的同時，又有一定的變異性，能夠提供豐富的系統(tǒng)學信息。基于ITS 序列等分子標記的DNA 條形碼鑒定是直接根據(jù)物種基因DNA 的多態(tài)特征進行的分子鑒定，ITS 序列種內(nèi)差異＜1%，種間差異為1.2%～10.2%，屬間差異為9.6%～28.8%[5-10]。本研究中，苦水玫瑰及參考物種的ITS 序列測序結(jié)果雙峰嚴重，無法進行序列比對與分析。

ITS2 序列相比于ITS 序列具有片段短、易擴增、易測序等優(yōu)點，對于DNA 已有降解的藥材也有較高的擴增成功率。Chen 等[11]基于6600 余個藥用植物樣本 對matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、ycf5、ITS1、ITS2 序列進行對比研究，結(jié)果表明，ITS2 序列的種間準確鑒定率最高，達到92.7%，因此提出將ITS2作為藥用植物的DNA條形碼候選序列。

ITS2序列長度短，大多為200～300 bp，擴增效率高，序列高度保守又具有適合的變異度，本研究收集的部分樣本為飲片，飲片的炮制加工可能會導致樣本DNA 的降解，嚴重影響PCR 擴增效率，因此，選擇序列長度較短的ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。

實驗用平陰玫瑰與對照藥材的ITS2 序列的質(zhì)量最高，且序列完全一致，苦水玫瑰的主要序列（序列6 和8）與平陰玫瑰及玫瑰對照藥材相比存在1～2個變異位點，月季、法蘭西玫瑰與平陰玫瑰及玫瑰對照藥材相比存在≥2個變異位點。

苦水玫瑰及其他同屬物種樣品的ITS2 序列相較于ITS 序列更易獲得，且具有相對保守的二級結(jié)構(gòu)，在物種鑒定中具有優(yōu)勢。對不同品種玫瑰ITS2 序列的變異位點、遺傳距離和NJ 樹聚類等分析表明，利用ITS2 序列能夠有效區(qū)分平陰玫瑰、苦水玫瑰、月季、法蘭西玫瑰的樣品。

本研究利用DNA 條形碼鑒定的方法進一步完善了苦水玫瑰的質(zhì)量標準，為市場中藥材及其混偽品的鑒別提供參考，同時為探討其他物種間的親緣關(guān)系提供了新的思路。