張平，黃聰琳，王曉琳，馬瀟*，楊平榮，鄭健

1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070；

2.甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；

3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；

4.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

苦水玫瑰Rosa rugose‘Kushui’屬薔薇科薔薇屬多年生常綠或落葉灌木，是中國(guó)玫瑰和鈍齒薔薇的雜交品種，因產(chǎn)地甘肅永登苦水鎮(zhèn)而得名，是一種具有藥食兩用價(jià)值的天然植物[1]。玫瑰花蕾低溫干燥用作玫瑰花茶，氣芳香濃郁，具有行氣解郁、消除疲勞、消炎殺菌、調(diào)節(jié)體質(zhì)、潤(rùn)澤肌膚等功效?？嗨倒遄鳛樗幨硟捎玫闹参?，有必要提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證使用上的準(zhǔn)確和安全。

分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展為藥材鑒定提供了新的思路，DNA 條形碼技術(shù)的應(yīng)用有利于藥食兩用植物的準(zhǔn)確鑒定。本研究按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部附錄9107“中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”[2]，對(duì)苦水玫瑰、平陰玫瑰R.rugosaThunb.、月季R.chinensisJacq.、金邊玫瑰R.Jinbian、法蘭西玫瑰R.gallicaL.的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）及ITS2 序列進(jìn)行研究分析[3]，并以玫瑰對(duì)照藥材作為參照物，利用苦水玫瑰序列的差異性對(duì)其進(jìn)行鑒別，以期從分子水平全面了解苦水玫瑰的序列特征，與其他玫瑰品種進(jìn)行區(qū)分，為培育玫瑰花優(yōu)良品種提供參考。

1 材料

1.1 樣品與試劑

樣品采自中國(guó)甘肅、山東、云南及臺(tái)灣，由甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院馬瀟主任藥師鑒定，具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

植物基因組DNA 提取試劑盒、2×TaqMaster Mix、定量Marker（北京天根生物技術(shù)有限公司）；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 儀器

8000M 型高能量球磨機(jī)（美國(guó)Spex 公司）；Veriti型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、3730XL型測(cè)序儀（美國(guó)ABI 公司）；JY600C 型水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；ZF-388 型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司）；MS205DU型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；Pacific RO 型純水儀、Nano Value8000型多樣品-微量紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾公司）；Codon Code Aligner 3.7.1序列拼接軟件（美國(guó)Codon Code公司）。

2 方法

2.1 樣品總DNA的提取

稱取供試品20 mg，每個(gè)供試品平行取樣2 份，利用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA。微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

2.2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增

ITS 序列擴(kuò)增引物正向?yàn)镮TS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向?yàn)镮TS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'；ITS2 序列擴(kuò)增引物正向?yàn)镮TS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向?yàn)镮TS3R：5'-GACGCTCTCCAGACTACAAT-3'。采用20 μL 反應(yīng)體系，包括DNA 模板3 μL（1 μL 約50 ng）、2×TaqMaster Mix 緩沖液10 μL、正反向引物各0.4 μL 及滅菌ddH2O 6.2 μL。陰性對(duì)照不加模板DNA，以滅菌ddH2O 補(bǔ)足體積。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

配制50×TAE緩沖液（稱取Na2EDTA·2H2O 37.2 g、Tris242g于1 L燒杯中，加入800 mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?。再加入冰醋?7.1 mL，充分混勻。加去離子水定容至1 L，室溫保存），稀釋50 倍得到1×TAE 工作液。制備含顯色劑ExRed（1∶10 000）的1.5%瓊脂糖凝膠，放入水平電泳槽，添加1×電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板，瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣槽內(nèi)加入擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL。設(shè)置電壓5 V·cm-1，進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約2 cm 處時(shí)，停止電泳。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序

對(duì)照DNA Marker，將電泳結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量正確的單一明亮條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.5 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序結(jié)果使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對(duì)拼接，去除引物區(qū)段，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法[4]，去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段，獲得ITS2 序列。將拼接好的序列于GenBank 上進(jìn)行比對(duì)分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于Kimura 雙參數(shù)模型（Kimura-2-parameter，K2P）計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，進(jìn)行barcoding gap分析。

利用MEGA 5.0 軟件基于K2P 模型，采用臨接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，使用1000 次重復(fù)檢測(cè)的Bootstrap 值表示樹(shù)上各節(jié)點(diǎn)的支持率。

3 結(jié)果與分析

3.1 電泳結(jié)果

取樣品提取DNA 片段，因受到色素等雜質(zhì)的影響，提取效果不理想，故將樣品分為花瓣和花梗分別粉碎取樣分析，結(jié)果表明，花梗類樣品提取的DNA 片段更佳，所受到的干擾小，故選擇用花梗粉末提取DNA 片段，擴(kuò)增后電泳。為了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，平陰玫瑰、月季、金邊玫瑰、法蘭西玫瑰均提取了2 份DNA 片段進(jìn)行電泳分析，玫瑰對(duì)照藥材因只有粉末故只提取了1 份，苦水玫瑰按表1 提取了7 份。玫瑰采集樣品與對(duì)照藥材ITS 和ITS2 序列的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1～2，均顯示為單一條帶。ITS 和ITS2 圖中部分電泳點(diǎn)顏色較淺，可能是樣品間存在差異，或提取DNA片段時(shí)雜質(zhì)干擾使片段不純。

3.2 ITS序列測(cè)序結(jié)果

電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，ITS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小接近750 bp（圖1），ITS2 引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小接近500 bp（圖2）。ITS引物的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大于ITS2 引物，理論上ITS 引物的擴(kuò)增產(chǎn)物攜帶更豐富堿基信息和鑒別位點(diǎn)，更適用于區(qū)分不同玫瑰品種。但是，測(cè)序結(jié)果顯示，ITS引物擴(kuò)增產(chǎn)物中大部分樣品的測(cè)序結(jié)果雙峰嚴(yán)重，無(wú)法有效拼接（圖3），可用數(shù)據(jù)量低，含不確定性堿基比例高，因此無(wú)法根據(jù)ITS 序列對(duì)苦水玫瑰及參考物種進(jìn)行序列比對(duì)與分析。

圖1 樣品ITS序列的PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 ITS2序列的PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 6號(hào)苦水玫瑰樣品ITS引物擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序峰圖

3.3 ITS2序列分析

3.3.1 ITS2 變異位點(diǎn)分析 測(cè)序序列使用Codon Code Aligner 3.7.1 軟件校對(duì)拼接，去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段后，獲得的ITS2 序列位點(diǎn)信息見(jiàn)圖4～5。7 個(gè)苦水玫瑰樣品獲得了2 個(gè)ITS2 單倍型，分別為6 和8 序列，存在1 個(gè)變異位點(diǎn)?？嗨倒迮c其他樣品ITS2 序列長(zhǎng)度均為213 bp，且物種序列相近?？嗨倒迮c玫瑰及玫瑰對(duì)照藥材存在1～2 個(gè)變異位點(diǎn)，與金邊玫瑰和法蘭西玫瑰存在2～3 個(gè)變異位點(diǎn)，主要變異區(qū)在156～208 bp，見(jiàn)表2。

表2 樣品ITS2變異位點(diǎn)分析

圖4 苦水玫瑰變異位點(diǎn)

3.3.2 ITS2 遺傳距離分析 苦水玫瑰6 與各物種間的平均遺傳距離為0.006 74，苦水玫瑰8 與各物種間的平均遺傳距離為0.011 58。苦水玫瑰種內(nèi)遺傳距離為0.004 80，苦水玫瑰與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離最遠(yuǎn)，其中苦水玫瑰8 與法蘭西玫瑰和金邊玫瑰的遺傳距離達(dá)0.014 51?？嗨倒? 與玫瑰對(duì)照藥材、玫瑰和月季序列的遺傳距離最近，僅為0.004 81，接近苦水玫瑰的種內(nèi)遺傳距離，見(jiàn)表3。

表3 樣品ITS2遺傳距離分析

圖5 苦水玫瑰與其他物種比較的變異位點(diǎn)

3.3.3 ITS2序列NJ樹(shù)聚類分析 利用MEGA 5.0軟件對(duì)苦水玫瑰樣品的ITS2 序列分析比對(duì)，鄰接法進(jìn)行聚類分析。聚類分析結(jié)果顯示，不同種有明顯區(qū)分，不同物種各聚為1 支，其中玫瑰和玫瑰對(duì)照藥材的遺傳距離相對(duì)接近，聚為1支。而2條苦水玫瑰序列種內(nèi)存在1 個(gè)變異位點(diǎn)，使其分為2 個(gè)單支，見(jiàn)圖6。

圖6 基于ITS2序列構(gòu)建的不同品種玫瑰的NJ系統(tǒng)聚類樹(shù)

4 討論與結(jié)論

被子植物的ITS 序列長(zhǎng)度通常為600～700 bp，在具有高度保守性和穩(wěn)定性的同時(shí)，又有一定的變異性，能夠提供豐富的系統(tǒng)學(xué)信息?；贗TS 序列等分子標(biāo)記的DNA 條形碼鑒定是直接根據(jù)物種基因DNA 的多態(tài)特征進(jìn)行的分子鑒定，ITS 序列種內(nèi)差異＜1%，種間差異為1.2%～10.2%，屬間差異為9.6%～28.8%[5-10]。本研究中，苦水玫瑰及參考物種的ITS 序列測(cè)序結(jié)果雙峰嚴(yán)重，無(wú)法進(jìn)行序列比對(duì)與分析。

ITS2 序列相比于ITS 序列具有片段短、易擴(kuò)增、易測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于DNA 已有降解的藥材也有較高的擴(kuò)增成功率。Chen 等[11]基于6600 余個(gè)藥用植物樣本 對(duì)matK、rbcL、trnH-psbA、rpoC1、ycf5、ITS1、ITS2 序列進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果表明，ITS2 序列的種間準(zhǔn)確鑒定率最高，達(dá)到92.7%，因此提出將ITS2作為藥用植物的DNA條形碼候選序列。

ITS2序列長(zhǎng)度短，大多為200～300 bp，擴(kuò)增效率高，序列高度保守又具有適合的變異度，本研究收集的部分樣本為飲片，飲片的炮制加工可能會(huì)導(dǎo)致樣本DNA 的降解，嚴(yán)重影響PCR 擴(kuò)增效率，因此，選擇序列長(zhǎng)度較短的ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。

實(shí)驗(yàn)用平陰玫瑰與對(duì)照藥材的ITS2 序列的質(zhì)量最高，且序列完全一致，苦水玫瑰的主要序列（序列6 和8）與平陰玫瑰及玫瑰對(duì)照藥材相比存在1～2個(gè)變異位點(diǎn)，月季、法蘭西玫瑰與平陰玫瑰及玫瑰對(duì)照藥材相比存在≥2個(gè)變異位點(diǎn)。

苦水玫瑰及其他同屬物種樣品的ITS2 序列相較于ITS 序列更易獲得，且具有相對(duì)保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在物種鑒定中具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)不同品種玫瑰ITS2 序列的變異位點(diǎn)、遺傳距離和NJ 樹(shù)聚類等分析表明，利用ITS2 序列能夠有效區(qū)分平陰玫瑰、苦水玫瑰、月季、法蘭西玫瑰的樣品。

本研究利用DNA 條形碼鑒定的方法進(jìn)一步完善了苦水玫瑰的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為市場(chǎng)中藥材及其混偽品的鑒別提供參考，同時(shí)為探討其他物種間的親緣關(guān)系提供了新的思路。