楊秀偉，張雷，徐嵬，鄭飛，白雪媛，陳長寶

1.北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；

2.長春中醫(yī)藥大學 吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117

人參Ginseng Radix et Rhizoma 系五加科多年生草本植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，為我國傳統(tǒng)中藥[1]，且其種植品被批準為新資源食品[2]。人參藥用始載于《神農本草經》，但直到1963 年，對其的研究才真正步入尋找藥效物質基礎的階段[3-4]。人參具有抗疲勞、保護心血管和肝臟系統(tǒng)、抗應激、抗誘變、抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗癌等藥理活性，尤其是具有適應原樣（adaptogenlike）作用，其主要活性成分為人參皂苷（ginsenoside，G）[5-7]。在長期的臨床實踐中，中醫(yī)形成了以口服為主的給藥途徑，中藥化學成分吸收進入系統(tǒng)循環(huán)之前往往需要在腸內細菌作用下活性化才能更好地發(fā)揮作用，這一機制的提出，為基于中藥化學成分體內生物轉化機制確定中藥有效成分和/或毒性成分[8-9]，以及通過尋找新藥先導化合物研制現(xiàn)代中藥開辟了新途徑[10]。本實驗采用超快速液相色譜-質譜/質譜法（UFLC-MS/MS）研究人參水提取物中的人參三萜（包括人參皂苷及其苷元）在人腸內細菌體外溫孵體系的轉化。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050 型超高效液相色譜-質譜儀，包括Nexera X2型UFLC液相系統(tǒng)（LC-30AD型二元泵、SIL-30AC 型自動進樣器、SPD-M30A 型檢測器和CTO-20AC型柱溫箱）、三重四極桿定量質譜［配備電噴霧離子源（ESI）和LabSolution 工作站］；Waters ACQUITY UPLC?BEHShield RP18色譜柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；WatersACQUITY UPLC?BEH Shield RP18VanGuardTM色譜柱（5 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；Thermo Scientific 1029 型厭氧培養(yǎng)箱，配有高純氮氣和高純三聯(lián)氣；XS105DU 型十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司）；AR4120 型萬分之一電子天平［奧豪斯國際貿易（上海）有限公司］；KQ5200型超聲波清洗儀（功率200 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；CV200型真空離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（Millipore公司）。

1.2 試藥

人參飲片（批號：PG-Y-201606）購自安國藥材市場，經北京大學藥學院楊秀偉教授鑒定為人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，憑證樣品存放于北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

LC-MS 級乙腈和甲醇購自Fisher Scientific 公司；HPLC 級醋酸銨（Sigma-Aldrich 公司）；內標地高辛（digoxin，批號：100015-200709，純度：98.8%，中國食品藥品檢定研究院）；自制超純水。

對照品20(S)-G-Rh1（1）、20(R)-G-Rh1（2）、G-Rg6（3）、G-F4（4）、G-Rk3（5）、G-Rh4（6）、G-Rg1（7）、20(S)-G-Rf（8）、20(R)-G-Rf（9）、20(S)-三七皂苷R2［20(S)-NG-R2，10］、20(R)-NG-R2（11）、20(S)-G-Rg2（12）、20(R)-G-Rg2（13）、G-Rs2（14）、G-Rs1（15）、G-Rd（16）、NG-R1（17）、G-Re2（18）、GRe（19）、20-glu-G-Rf（20）、西洋參皂苷R1（Q-R1，21）、G-Ro（22）、G-Rb1（23）、G-Rc（24）、G-Rb2（25）、G-Ra2（26）、G-Ra3（27）、G-Rb3（28）[11]、G-Re1（29）、G-Re4（30）、G-Ra1（31）[12]、G-Rs4（32）、20(S)-G-Rs3（33）、20(R)-G-Rs3（34）、NG-R4（35）、G-Rk1（36）、G-Rg5（37）、20(S)-G-Rg3（38）、20(R) -G-Rg3（39）、G-Rg9（40）[11]、20(S) -G-Rh2（42）、20(R)-G-Rh2（43）、20(S)-原人參三醇［20(S)-PPT，44］、20(R)-PPT（45）、20(S)-原人參二醇［20(S)-PPD，46］、20(R)-PPD（47）[13]均為本課題組從紅參[11]、生曬參[12]、人參莖葉[13]中得到；對照品竹節(jié)參皂苷Ⅳ（CS-Ⅳ，41）、CS-Ⅳa（48）和G-CK（49）購自成都曼思特生物科技有限公司；所有化合物純度經液相色譜-質譜法（LC-MS）驗證均大于98%。以上49個對照品的化學結構式見圖1。

圖1 49個人參皂苷和內標地高辛結構

按標準規(guī)程[14]制備一般厭氧培養(yǎng)基（GAM），成分為蛋白胨15.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、大豆胨5.0 g·L-1、牛肉粉5.0 g·L-1、葡萄糖5.0 g·L-1、氯化鈉5.0 g·L-1、可溶性淀粉3.0 g·L-1、半胱氨酸0.5 g·L-1、磷酸二氫鉀2.5 g·L-1、氯化血紅素0.005 g·L-1、維生素K10.001 g·L-1。

2 方法

2.1 人參總三萜的制備

稱取人參飲片5 g，加入蒸餾水275 mL，加熱回流提取2 h，濾過。濾渣再次加入蒸餾水275 mL，加熱回流2 h，濾過后合并2次濾液，水浴蒸至約50 mL，加入乙醇100 mL使乙醇體積分數(shù)約為65%，4 ℃靜置過夜，3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為11 cm），收集上清液。上清液減壓濃縮除去乙醇后冷凍干燥，稱定質量，得到人參總三萜（包括三萜皂苷及其苷元）提取物，密封保存。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，溶解于質譜級甲醇中制成質量濃度為1.0 mg·mL-1的對照品儲備液，分別移取適量儲備液混合并稀釋制成混合對照品母液，然后用甲醇連續(xù)稀釋得到系列質量濃度溶液，濃縮干燥后加入含有滅活腸內細菌的培養(yǎng)基中，加入內標地高辛溶液（1 mg·mL-1）5 μL，再加入乙酸乙酯3 mL，充分渦旋后15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為82 mm），分出乙酸乙酯層，用乙酸乙酯重復萃取3 次。用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次3 mL。合并正丁醇萃取液，用少量水洗3 次。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮干燥。殘渣加入甲醇1 mL 溶解，15 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為82 mm），上清液過0.22 μm 微孔濾膜，進行UFLCMS/MS分析。

2.3 厭氧培養(yǎng)基的配制和人腸內菌叢的制備

按操作規(guī)程[14]，取10 號自封袋，充滿氮氣，置換掉自封袋內的氣體，擠壓出氣體后再通入氮氣。如此重復2 次，再次充滿氮氣，將志愿者一次排出的所有糞便裝入自封袋，封口，并用手擠壓自封袋使糞便均質化；通過厭氧箱的置換倉將糞便轉移至厭氧無菌操作條件下，取糞便3～5 g，放入配制好的GAM 溶液200 mL 中，加塞封口；置厭氧培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；取出菌液1 mL，加至已裝有滅菌GAM 溶液約40 mL 的具塞錐形瓶中，37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h，取出，置于4 ℃冰箱保存，即為人腸內細菌混合菌叢。

2.4 人參總三萜的人腸內細菌生物轉化

準確稱取2.1 項下人參總三萜提取物0.524 g（折合人參飲片1 g），加入到4 mL蒸餾水中，超聲使充分溶解后轉移至厭氧培養(yǎng)箱中。分別于10 mL 離心管中加入空白GAM 溶液3 mL、人腸內細菌液0.2 mL 和人參總三萜提取物溶液0.1 mL。密封后轉移至搖床，在37 ℃、100 r·min-1溫孵培養(yǎng)，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h 取出，加入乙酸乙酯3 mL 滅活，加入內標地高辛溶液（1 mg·mL-1）5 μL，充分渦旋后離心，分出乙酸乙酯層，再次加入乙酸乙酯3 mL，重復萃取3 次。乙酸乙酯萃取完成后加入水飽和正丁醇再萃取3 次，每次3 mL，合并正丁醇萃取液，用少量水洗3 次。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮干燥。殘渣加入甲醇1 mL 溶解，在15 000 r·min-1離心（離心半徑為82 mm）10 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜，上樣UFLC-MS/MS 系統(tǒng)進行分析。

2.5 UFLC-MS/MS分析方法的建立和方法學考察

2.5.1 色譜及質譜條件 綜合考慮分析物質譜優(yōu)化的結果和生物基質中可能存在的干擾成分的影響，最終選擇0.5 mmol·L-1的醋酸銨水溶液（A）和乙腈（B）作為流動相，梯度洗脫（0～3 min，80%～78%A；3～5min，78%～70%A；5～9min，70%～67%A；9～11min，67%～65%A；11～13 min，65%～58%A；13～23 min，58%～53%A；23～24 min，53%～48%A；24～29 min，48%～45%A；29～29.1min，45%～40%A；29.1～34min，40%～35%A；34～36 min，35%～5%A）；流速為0.4 mL·min-1；進樣體積為1 μL；柱溫為30 ℃。

優(yōu)化后的質譜參數(shù)為霧化氣流速：3 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；接口加熱器溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；接口電壓：-3.0 kV；檢測器電壓：1.80 kV；電離源為ESI；掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）；掃描模式為負離子模式。

2.5.2 方法學驗證 按文獻方法分別對分析方法的專屬性、線性、定量下限和檢測下限、日內和日間精密度及準確度、回收率、基質效應和穩(wěn)定性進行考察[15]。

3 結果與討論

3.1 UFLC-MS/MS分析方法的建立

利用單獨的對照品溶液分別優(yōu)化每個分析物的MRM 參數(shù)，利用混合對照品溶液進行色譜分離方法優(yōu)化。49個化合物經過優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表1。

表1 49個分析物和內標地高辛優(yōu)化后的MRM參數(shù)

續(xù)表1

3.2 UFLC-MS/MS分析方法的方法學驗證

經方法學考察，空白基質不會干擾人參皂苷和苷元的定量分析（圖2～3），49 個化合物線性、精密度和準確性、回收率和穩(wěn)定性均符合生物樣品分析的要求。

圖2 空白基質樣品MRM疊加圖

3.3 樣品前處理方法優(yōu)化

培養(yǎng)腸內細菌的培養(yǎng)基成分復雜，很容易對色譜柱和分析儀器帶來不可逆的破壞。因此，有必要對前處理方法進行優(yōu)化以保證在保留待測成分基礎上盡可能多地去除干擾物質。液-液萃取是比較常用的樣品前處理方法，乙酸乙酯和正丁醇是2 種最為常用的萃取溶劑。在最初篩選萃取溶劑時，為盡可能多的去除雜質，只選擇乙酸乙酯，以2倍量體積加入，連續(xù)萃取6 次，萃取液蒸干后加入甲醇100 μL進行UFLC-MS/MS 分析。結果表明，極性較大的人參皂苷如G-Rb1等得不到滿意的回收率。當分別用乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取3 次時，低極性和高極性的人參皂苷均能被很好地萃取出來。因此選擇乙酸乙酯和正丁醇作為萃取溶劑進行樣品制備。

圖3 對照品溶液中49個分析物和內標地高辛MRM疊加圖

3.4 人參三萜的人腸內菌體外溫孵生物轉化特征研究

3.4.1 不同類型人參三萜在人腸內菌體外溫孵轉化途徑 人參三萜包括人參三萜皂苷（簡稱人參皂苷）及其苷元。人參皂苷通常含有多個糖基，這些糖基在腸內細菌的糖苷酶作用下會發(fā)生水解，生成相應的脫糖基產物。對22 個PPT 型、24 個PPD 型和3 個齊墩果烷（OLE）型人參皂苷及其皂苷元的轉化特征及時間-濃度曲線進行研究。PPD 型人參皂苷及其苷元包括G-Rs1、G-Rs2、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3、G-Rs4、Q-R1、G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rb1、GRb2、G-Rb3、G-Rc、G-Rd、NG-R4、G-Rk1、G-Rg5、20(S)-G-Rg3、20(R)-G-Rg3、20(S)-G-Rh2、20(R)-GRh2、G-CK、20(S)-PPD 和20(R)-PPD；PPT 型人參皂苷及其苷元包括G-Re、G-Re1、G-Re2、G-Re4、20(S)-G-Rf、20(R)-G-Rf、20-glu-G-Rf、G-Rg1、20(S)-GRg2、20(R)-G-Rg2、G-Rg6、G-Rg9、20(S)-G-Rh1、20(R)-G-Rh1、G-Rh4、G-F4、G-Rk3、NG-R1、20(S)-NGR2、20(R)-NG-R2、20(S)-PPT 和20(R)-PPT；OLE 型人參皂苷包括G-Ro、CS-Ⅳ和CS-Ⅳa。根據各人參皂苷在腸內細菌作用下的含量變化趨勢和相關文獻，分別總結出了PPD、PPT 和OLE 型人參皂苷在腸內細菌作用下的轉化途徑。

以G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3為例，PPD類型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑見圖4。G-Rb3脫糖基轉化為G-Rd，可再轉化為G-Rg3、G-Rh2、PPD、G-Rg5和G-Rk1。苷元C-3 糖鏈末端葡萄糖基的C-6 結合乙?；腉-Rs1和G-Rs2由酯解酶作用下轉化為G-Rd，此后依圖4 所示轉化；而G-Rs3由酯解酶作用下轉化為G-Rg3，此后依圖4所示轉化。

圖4 PPD類型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑

以G-Re 為例，PPT 類型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑見圖5。OLE型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑比較簡單，見圖6。

圖5 PPT型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑

圖6 OLE型人參皂苷在人腸內細菌作用下可能的轉化途徑

3.4.2 不同類型人參三萜在人腸內菌體外溫孵轉化特征 利用內標法計算單個人參皂苷在每個時間點的含量，結果見表2。當腸內細菌和人參三萜同時加入，2 h 內幾乎所有化合物均較為穩(wěn)定。2 h 后大部分成分的含量開始迅速變化，同時溫孵液明顯渾濁，表明腸內菌生長和人參三萜轉化隨之進行。所有人參皂苷，無論是PPD、PPT 型還是OLE 型，其整體的變化趨勢均為隨溫孵時間延長，含糖基較多的皂苷含量逐漸下降，同時含糖基較少的皂苷含量逐漸上升。根據含量測定結果可知，不同類型的人參皂苷在轉化能力方面有非常明顯的差異。整體來說，PPD 型人參皂苷轉化程度較PPT 型要高；OLE型人參皂苷也會在腸內細菌作用下發(fā)生明顯轉化；連有乙?；娜藚⒃碥崭菀自谀c內菌作用下水解。與加入初期相比，經過72 h 溫孵后其含量上升超過30%的化合物包括G-Rd、20(S)-G-Rh2、20(R)-G-Rh2、20(S)-PPT、20(R)-PPT、20(S)-PPD、20(R)-PPD、GCK 和CS-Ⅳa。其中20(S)-G-Rh2、20(S)-PPD 和G-CK的含量變化最為明顯，尤其是G-CK的含量變?yōu)槌跏贾档?0 倍。除G-Rd 外，這些化合物均為低極性人參皂苷或皂苷元。這表明，在腸內菌叢的作用下，人參皂苷非常容易脫去糖基生成G-CK 以及幾個苷元，而這些轉化產物不僅吸收能力更強，體內外實驗也證明其具有著更好的生物學活性。經過72 h 溫孵質量分數(shù)下降超過30%的化合物包括20(S)-G-Rf、G-Rg1、G-Rs1、G-Rs2、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3、GRs4、NG-R1、NG-R4、G-Re、G-Re1、G-Re2、G-Re4、Q-R1、G-Ro、G-Rb1、G-Rb2、G-Rb3、G-Rc、G-Ra1、G-Ra2、G-Ra3、G-Rk1和CS-Ⅳ。從這些化合物的結構來看，其往往含有多個糖基，這些糖基容易在腸內菌作用下水解脫去，最終形成對應的次級苷或者苷元。

表2 人參三萜提取物中49個成分的人腸內細菌體外溫孵過程中的質量分數(shù)

續(xù)表2

幾個帶有乙酰基的人參皂苷質量分數(shù)下降非常迅速，G-Rs1、G-Rs2、Q-R1等連有糖基較多的化合物下降更為明顯，在6～8 h 時基本已經降到初始質量分數(shù)的10%左右。幾個連糖基較少的皂苷如G-Rs4、20(S)-G-Rs3、20(R)-G-Rs3質量分數(shù)下降相對較緩，在12 h 左右才基本不再變化?？赡艿脑蚴沁B有乙?；幕衔镌谀c內菌的作用下會同時發(fā)生脫乙?；兔撎腔磻?，此三者會在轉化過程中不斷的生成和消耗，最終表現(xiàn)為含量緩慢下降。

PPD 型人參皂苷含量下降非常明顯，到72 h 時大部分化合物的質量分數(shù)均下降了50%以上，表明腸內菌中的酶更容易與PPD 型人參皂苷發(fā)生作用，使其發(fā)生水解。從圖4 可以看出，G-Rd 是腸內菌水解人參皂苷過程中非常重要的中間產物，其含量隨著時間具有明顯的波動性變化。從圖7 可以看出，在最初的時候G-Rd的水解生成占據主導地位，其含量明顯上升，到8 h時含量達到最高。而隨著其他化合物轉化生成的逐漸減少以及G-Rd進一步轉化的增加，其含量開始緩慢下降或者波動。但即使72 h 以后，G-Rd的含量仍然是初始值的2倍以上。說明G-Rd在體內滯留時間長，發(fā)揮藥效作用不容小視。

圖7 人參提取物中G-Rd的人腸內菌體外溫孵含量-時間曲線

此外，還有2 個比較特殊的人參皂苷為G-Re1和G-Re2，兩者均為PPT 型皂苷。這2 個化合物的含量變化和G-Rd 相似，均為先上升后下降，在6 h 時含量達到最高點（圖8）。而結構類似的G-Re 和G-Re4則沒有這一特點。比較2 類化合物的結構差異，發(fā)現(xiàn)G-Re1和G-Re2的糖基只有葡萄糖基，而G-Re 和G-Re4除葡萄糖基外還含有其他類型的糖基。結果表明，人參提取物中可能存在一類與G-Re1、G-Re2結構類似但連有更多的糖基、乙?；虮；腜PT 型人參皂苷，在腸內菌的作用下某些基團被水解生成G-Re1和G-Re2。同時這2 個化合物本身極性也較大，會在腸內菌作用下發(fā)生進一步水解。

圖8 人參提取物中G-Re1和G-Re2的人腸內菌體外溫孵含量-時間曲線

此外，隨著溫孵時間的延長，3個OLE型人參皂苷的含量也變化明顯，G-Ro 在前4 h 變化比較緩慢，從6 h開始含量逐漸下降，72 h時含量下降已十分明顯。CS-Ⅳ的含量持續(xù)降低，從12 h 開始明顯下降。CS-Ⅳa含量則有明顯的先升后降過程，其含量在前幾個小時逐漸上升，至12 h達到頂點，后續(xù)則開始逐漸下降。這與G-Rd 的轉化特征較類似。根據結構可知，CS-Ⅳa 可由G-Ro、CS-Ⅳ以及其他OLE 型皂苷轉化生成，因此其含量表現(xiàn)出了隨時間波動的特點。

從以上結果可以看出，在人腸內菌叢作用下，各人參皂苷的初始質量濃度并不能代表其實際在腸道中被吸收時的質量濃度，某些化合物的含量在腸內菌的作用下會發(fā)生顯著的變化。通過生物轉化，部分人參皂苷的含量提高，如化合物G-Rd、G-CK、PPD 和PPT 等低極性人參皂苷和皂苷元。因此，即使這些化合物在生藥人參中初始含量極低，在口服給藥后仍能在動物體內大量檢測到。值得一提的是，動物體內不管是在腸內菌種類上還是在數(shù)量上均會明顯高于體外模型，優(yōu)勢菌的種類也會有所不同。因此，在體模型中人參皂苷的轉化會更為明顯。

4 結論

本研究利用UFLC-MS/MS，對人參三萜提取物中49個化合物在人腸內菌作用下的轉化特點和時間-含量變化曲線進行了研究。人參三萜在人腸內菌作用下會發(fā)生明顯的生物轉化，根據總結得到的PPT、PPD 和OLE 型人參三萜的轉化途徑可知脫糖基水解是人參三萜（人參皂苷）在腸內菌液中最主要的轉化方式，其次還可能伴有脫水以及異構化。轉化最后絕大多數(shù)高極性人參皂苷含量明顯降低，同時會生成大量具有良好藥理活性的G-CK、PPD 和PPT 等低極性人參皂苷和皂苷元。此外，發(fā)現(xiàn)PPD 型人參皂苷在人腸內菌叢作用下的轉化能力最強，PPT 型人參皂苷則相對較弱，OLE 型人參皂苷也有比較明顯的轉化趨勢。當人參皂苷分子上再連有乙酰基后，其在腸內菌作用下的轉化能力大大增加。