曹錦濤，陳劉成，李 然，閔 銳，唐明洋，范星宇，李 楠

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，全球每年有53萬新發(fā)病例和31萬死亡病例，絕大多數(shù)子宮頸癌是由于人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染引起[1-2]。近年來，隨著子宮頸細胞學篩查(巴式涂片)和接種HPV疫苗等預防措施的開展，其發(fā)病率已顯著降低[3]。但對于晚期轉(zhuǎn)移性或復發(fā)性患者，臨床上尚缺乏有效的治療方法[4]。CD151(cluster of differentiation 151)是四跨膜蛋白家族(transmember four super family, TMASF)的重要成員，影響細胞的黏附、遷移與增殖，可在腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)[5-6]。王麗等[7]的實驗結(jié)果顯示CD151蛋白表達與腫瘤細胞的增殖反應有較強的相關(guān)性，下調(diào)細胞中CD151蛋白表達，可抑制腫瘤細胞的增殖，但CD151基因在子宮頸癌組織中作用的相關(guān)機制目前尚不清楚。本實驗采用免疫組化EnVision法檢測了CD151蛋白在子宮頸鱗狀細胞癌及慢性子宮頸炎組織中的表達情況，并采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默子宮頸癌細胞中CD151基因表達，通過檢測其增殖、遷移、侵襲能力的改變進一步探究CD151基因在子宮頸癌中的作用，為CD151基因作為治療子宮頸癌潛在靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑將子宮頸腺癌細胞株Hela(中國科學院上海細胞庫)用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室、4%多聚甲醛、瑞氏-吉姆薩染料(上海碧云天公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 收集2016～2019年蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的子宮頸癌標本58例，慢性子宮頸炎標本34例。采用免疫組化EnVision法檢測CD151蛋白表達。組織切片常規(guī)脫蠟脫水，使用3%H2O2甲醇滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，依次滴加一抗、二抗和三抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固，鏡下觀察。陽性結(jié)果判定以細胞膜或細胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染和分組 從Genebank中檢索人CD151全長cDNA序列，設計siRNA-CD151序列，用以上確認的siRNA-CD151干擾序列為基礎，合成shRNA-CD151。用脂質(zhì)體Lipofectamine介導重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的子宮頸癌細胞株。實驗分3組，即Psciencer2.0-shRNA-CD151質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Psciencer2.0-shRNA-CD151的子宮頸癌細胞，簡稱CD151 siRNA組)、空載體組(轉(zhuǎn)染Psciencer2.0-shRNA空載體的子宮頸癌細胞)及空白對照組(未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的子宮頸癌細胞)。

1.2.3Western blot法檢測CD151的表達 取上述3組細胞2×105個/孔細胞接種在6孔板中，待生長至密度達到80%后，將細胞用冷PBS洗滌2次，加入100 μL的RIPA細胞裂解液，用細胞刮刮下。采用BCA法定量蛋白，將含有蛋白的細胞裂解液按4 ∶1比例與5XSDS上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸10 min，然后進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜。將膜用TBST洗滌3次，每次10 min，在室溫下與合適的HRP標記的二抗孵育1 h。通過增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測蛋白條帶。

1.2.4細胞增殖實驗 取上述3組細胞，將細胞以每孔5×103個均勻接種于96孔板中，并設置調(diào)零組(只含有細胞培養(yǎng)基不含有細胞)，培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8，再孵育2 h后用酶標儀測量450 nm處的吸光度。細胞活力計算公式：細胞活力=(實驗組-調(diào)零組)/(空白對照組-調(diào)零對照組)×100%，實驗重復3次，取平均值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 用不含有EDTA的胰酶消化細胞，1 500 r/min離心5 min，收集2×105個細胞，PBS洗2次，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染料室溫避光孵育30 min，用100 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，轉(zhuǎn)移至流式管流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期 每組離心收集2×105個細胞，PBS洗2次，將細胞加入提前預冷的75%乙醇，4 ℃固定24 h。1 000g離心5 min收集細胞，用PBS洗細胞1次，每組加入配置好的碘化丙啶染液0.535 mL(含有0.5 mL染色緩沖液、25 μL的20×PI染色液、10 μL的50×RNase A)，于37 ℃避光孵育30 min，轉(zhuǎn)移至流式管流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.2.7細胞遷移、侵襲實驗 先使用無血清培養(yǎng)基將細胞饑餓化處理24 h后再行后續(xù)實驗。使用胰酶消化細胞后，用不含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為每毫升1×105個，每組取200 μL細胞懸液加入Transwell小室Matrigel基質(zhì)膠表面，24孔板下室每孔內(nèi)加入含0.1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL。在37 ℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，使用棉試紙擦去濾膜表面的細胞，再用4%多聚甲醛固定20 min，并用吉姆薩染色5 min。于400倍鏡下計數(shù)穿過濾膜的細胞數(shù)，每膜隨機計數(shù)上、下、左、右、中5個不同視野，每組設3個平行濾膜。遷移實驗不需要鋪Matrigel基底膠。實驗重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌和子宮頸慢性炎組織中CD151蛋白的表達子宮頸癌組織中CD151蛋白陽性，定位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒樣；子宮頸慢性炎組織中CD151蛋白陰性(圖1)。

圖1 A.子宮頸鱗狀細胞癌HE染色，癌細胞呈浸潤性生長；B.子宮頸鱗狀細胞癌中CD151陽性，EnVision法；C.子宮頸慢性炎上皮組織HE染色，鱗狀上皮層次清晰，結(jié)構(gòu)完整；D.子宮頸慢性炎上皮組織中CD151陰性，EnVision法

2.2 Western blot法檢測各組中CD151蛋白表達實驗結(jié)果顯示，CD151 siRNA組的CD151蛋白表達水平顯著低于空載體組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？蛰d體組及空白對照組的CD151表達量約為CD151 siRNA組的9倍(圖2)。上述結(jié)果表明，CD151 siRNA組的CD151表達水平顯著下降。

圖2 Western blot法檢測各組中CD151蛋白表達水平：A.電泳圖；B.直方圖；與空載體組及空白對照組相比，*P<0.05

2.3 沉默CD151基因表達對子宮頸癌細胞增殖能力的影響CCK-8細胞增殖實驗檢測CD151在體外對子宮頸癌細胞增殖的作用，結(jié)果表明，CD151 siRNA組細胞在450 nm處的OD值明顯低于空載體組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。此外CD151 siRNA組的細胞活力明顯低于空載體組及空白對照組(圖4)，由此確定通過RNAi介導的CD151基因沉默可顯著抑制子宮頸癌細胞系的增殖與活力。

圖3 CCK-8法檢測CD151對細胞增殖能力的影響與空載體組及空白對照組相比，*P<0.05

圖4 CD151對細胞活力的影響與空載體組及空白對照組相比，*P<0.05

2.4 流式細胞術(shù)檢測CD151對細胞凋亡與周期的影響細胞凋亡流式圖顯示，在細胞周期早期，CD151 siRNA組細胞凋亡數(shù)量明顯高于空載體組及空白對照組(圖5)，表明CD151低表達可促進細胞早期凋亡；流式細胞分析結(jié)果顯示，CD151 siRNA組G1期細胞數(shù)量高于空載體組及空白對照組，CD151 siRNA組的S期細胞數(shù)量則明顯低于空載體組及空白對照組(圖6)，提示CD151表達水平降低可使細胞發(fā)生G1/S抑制；柱狀圖顯示CD151 siRNA組G1期細胞數(shù)量明顯高于空載體組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖7)，進一步證實CD151低表達可將細胞周期阻滯在G1期。

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖6 流式細胞儀檢測細胞周期

圖7 CD151表達對細胞周期的影響與空載體組及空白對照組相比，*P<0.05

2.5 沉默CD151基因表達對子宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的影響Transwell法檢測不同分組中癌細胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，CD151 siRNA組細胞穿過濾膜的細胞數(shù)明顯低于空載體組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖8、9)，空載體組和空白對照組之間穿膜細胞數(shù)差異無顯著性。表明CD151表達缺失可顯著降低癌細胞的遷移及侵襲能力。

圖8 Transwell實驗檢測各組細胞的遷移能力與空載體組和空白對照組相比，*P<0.05

3 討論

子宮頸癌位居全球女性癌癥發(fā)病率和病死率的第4位，基因治療作為治療子宮頸癌的新方法而倍受關(guān)注[8]。鑒于CD151在子宮頸鱗狀細胞癌組織中高表達，在慢性子宮頸炎組織中呈陰性，推斷CD151基因的激活可能是子宮頸癌癌變過程中的重要因素，而CD151過表達可能會促進子宮頸細胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化。

CD151是最早發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的四跨膜蛋白，是整合素依賴性細胞運動信號轉(zhuǎn)導中必不可少的分子連接物，整合素定位的變化被認為是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的決定因素[9-10]。整合素受體(即α6β1、α3β1和α6β4)與CD151結(jié)合可形成牢固且極其穩(wěn)定的CD151-整合素復合體，后者可能通過調(diào)節(jié)FAK、ERK、Akt、Wnt等信號分子的活性，促進腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，破壞該復合體的形成可有效減弱腫瘤的惡性生物學作用[11-13]。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，其磷酸化后，可將上游信號整合并傳遞，參與調(diào)控細胞骨架重組、收縮、黏著斑解聚與形成，進而調(diào)節(jié)細胞運動，是腫瘤細胞侵襲的關(guān)鍵[14]。楊秀婷等[15]在肺腺癌的研究中亦證實了該結(jié)果，認為CD151可促使FAK-P130Cas信號通路磷酸化表達增加，而破壞CD151-整合素復合體，則會減少該信號通路的激活，提示CD151可能通過激活FAK-P130Cas通路參與癌細胞的遷移。此外，CD151還可通過激活ERK信號通路促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞在體外基質(zhì)膠上的管型結(jié)構(gòu)形成，促進體外血管的生成[16]。另有研究證明，在肝細胞癌中CD151可通過激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信號通路，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)對肝癌的促進作用[17-18]。研究證實，Wnt信號通路與腫瘤轉(zhuǎn)移以及腫瘤內(nèi)部微血管的形成密切相關(guān)，而CD151與整合素α3β1結(jié)合可通過Wnt通路以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用調(diào)節(jié)卵巢癌的生長[19]。由此可見，CD151參與了細胞黏附、細胞外基質(zhì)黏附并促進內(nèi)皮細胞的移行及微血管形成，推動了腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此CD151被認為是潛在的藥物靶點，用于開發(fā)免疫療法、生物制劑等[20-21]。如CD151肽作為腫瘤疫苗在小鼠乳腺癌和肝癌模型中激活CD8+IFN-γ+淋巴細胞抑制腫瘤增殖，提示CD151肽引發(fā)的抗腫瘤活性免疫可能成為抑制腫瘤進展的有效方法[22]。有研究證實CD151基因在皮膚鱗狀細胞癌組織中高表達，激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3以支持角質(zhì)形成細胞的存活和增殖；沉默CD151基因表達可導致皮膚鱗狀細胞癌細胞生長抑制，裸鼠實驗亦證實了CD151基因沉默可有效減緩腫瘤的生長，其機制可能與促進細胞凋亡有關(guān)[23]。值得注意的是，有些研究發(fā)現(xiàn)CD151、CD9和CD63四跨膜蛋白的表達降低可與腫瘤更惡性的表型有關(guān)，另一些研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中CD151表達與腫瘤轉(zhuǎn)移進展之間呈反比關(guān)系[24-26]。

圖9 Transwell實驗檢測各組細胞的侵襲能力與空載體組和空白對照組相比，*P<0.05

本實驗采用免疫組化法檢測子宮頸鱗狀細胞癌組織中CD151蛋白的表達，并通過RNAi介導CD151基因沉默，觀察其對子宮頸癌細胞生長、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，CD151在子宮頸癌組織中陽性；CD151低表達可抑制子宮頸癌細胞的增殖；CD151 siRNA組中的癌細胞比空載體組和空白對照組更多地進入了早期凋亡并且多數(shù)細胞周期停滯于G1期，這提示CD151表達缺失可顯著促進癌細胞凋亡且能阻滯癌細胞周期的進展。CD151 siRNA組癌細胞較空載體組和空白對照組細胞的遷移和侵襲能力顯著降低，提示沉默CD151基因表達可抑制子宮頸癌細胞的遷移、侵襲，但其相關(guān)分子機制尚不明確。本實驗結(jié)果可為臨床治療子宮頸癌提供新思路，如針對CD151的特性，利用RNA干擾、免疫治療等技術(shù)結(jié)合新的藥物遞送系統(tǒng)靶向殺傷易侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞。CD151既參與調(diào)節(jié)細胞的正常生理過程，如細胞黏附、運動、活化和增殖，又參與促進腫瘤病理過程的發(fā)生、發(fā)展。由于侵襲和轉(zhuǎn)移是造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因，因此，本實驗下一步著重探討CD151參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制，探尋子宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移過程所處微環(huán)境中復雜的信號通路，再通過激活或沉默相關(guān)信號分子，抑制腫瘤進展，為臨床診治提供更多有效的方法。

綜上所述，CD151蛋白在子宮頸癌組織中高表達，將其基因沉默后可以使子宮頸癌的細胞增殖和遷移能力受抑制，CD151檢測有望成為子宮頸癌預后評價的一種新分子生物學指標。