林永娟 俞婷婷 李會穎 尹震宇 郭愛斌

軟腦膜轉(zhuǎn)移（leptomeningeal metastasis, LM）又稱為癌性腦膜炎，是晚期肺癌最致命的并發(fā)癥之一[1]，發(fā)生率為5%-10%[2]，患者預(yù)后差，平均生存期僅3.5個月-6個月[3]，少數(shù)患者生存時間超過12個月[4]，尤其是有靶點突變的肺癌患者[5]。因此，早期診斷和治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵。腦脊液（cerebrospinal fluid, CSF）細胞學(xué)檢查是診斷LM的金標準，但敏感性僅50%-60%[6]。CSF中腫瘤標志物（tumor markers, TM）對LM同樣具有診斷作用[7]。生理條件下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）幾乎不生成TM[8]。病理條件下，血腦屏障（blood brain barrier, BBB）受到破壞，可使TM從血液進入CSF，或由CNS分泌TM的癌細胞鞘內(nèi)合成，均可使CSF中TM增高[9]，因此，通過檢測BBB的完整程度及是否存在鞘內(nèi)TM合成，可幫助判斷CSF中TM的來源，對LM診斷和鑒別診斷具有重要意義?？紤]到CSF中TM來源與CNS疾病過程中免疫球蛋白（immunoglobulin G, IgG）生成相似，分子量相近，文獻[10]報道CSF和血清TM商值（TM CSF/serum quotients,Q TM）與CSF和血清白蛋白商值（albumin CSF/serum quotients, QA）具有相關(guān)性。Corsini等[11]通過分析CSF和血清癌胚抗原（carbohydrate antigen, CEA）商值與QA的比值，評估判斷CSF中CEA的來源，進一步提高了CSF中CEA在LM輔助診斷的敏感性。因此，本研究入組了肺癌伴LM患者，檢測對肺癌診斷敏感性高的肺癌四項，即CEA、糖類抗原125（carbohydrate antigen125, CA125）、細胞角蛋白19片斷抗原（cytokeratin 19 fragments,CYFRA21-1）和神經(jīng)元烯醇化酶（neurone specific enolase,NSE），通過計算QA評估BBB的完整性、TM指數(shù)公式即Q TM/QA評估CNS中鞘內(nèi)TM的合成，以分析肺癌LM患者CSF中TM來源，旨在提高4種TM在該人群輔助診斷的可行性和敏感性，并進一步討論TM在肺癌LM療效評價中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 研究者 本研究回顧性分析于2016年12月-2020年3月入住南京大學(xué)附屬南京鼓樓醫(yī)院的肺癌伴LM患者（LM組），入組標準：①經(jīng)病理確診的肺癌患者；②CSF細胞學(xué)找到癌細胞；③新發(fā)的臨床系統(tǒng)癥狀/體征；④典型的核磁共振（magnetic resonance imaging, MRI）影像學(xué)表現(xiàn)；其中LM的診斷需同時滿足條件①，同時滿足②、③、④中至少2項。排除標準：①無法獲得同期CSF及血清白蛋白水平、TM水平；②半年內(nèi)有腦炎、顱腦外傷及腦部放療史。其中49例診斷為LM，最終入組可獲得同期血清和CSF檢測指標的患者共25例。LM組所有患者原發(fā)病由病理學(xué)確診。治療上，所有患者前期均經(jīng)過多種綜合治療方案（包括靶向治療、多線化療、免疫治療等），LM組均植入Ommaya囊，行經(jīng)Ommaya囊CSF引流、全身治療聯(lián)合腦室內(nèi)化療。

1.1.2 對照組 為了進一步評估LM組鞘內(nèi)合成TM的特異性，選取同期在南京鼓樓醫(yī)院診治的57例非惡性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。╪onmalignant neurological diseases, NMNDs）患者（NMNDs組）的CSF和血清白蛋白、TM檢測值作為對照，所有患者均經(jīng)腰椎穿刺和影像學(xué)檢查，排除惡性疾病依據(jù)。其中31例（54.4%）為神經(jīng)系統(tǒng)感染疾病，26例（45.6%）為腦膜瘤。

1.2 實驗方法

1.2.1 腦脊液相關(guān)指標檢測 所有LM組、NMNDs組患者均經(jīng)腰椎穿刺術(shù)取CSF，同時抽取外周血行相關(guān)指標檢測。并記錄CSF常規(guī)（細胞數(shù)）、生化項目指標（如糖、氯化物、白蛋白水平）。同時收集患者CSF和外周血清，行肺癌指標CEA、CA125、CYFRA21-1、NSE檢測。所有標本在采集2 h內(nèi)完成檢測項目。其中評估CSF中TM檢出情況時，CSF中TM陽性界值參考前期研究中陽性值：即CEA>6.67 ng/mL，CA125>33.44 U/mL，CYFせ21-1>4.22 ng/mL，NSE>13.03 ng/mL[12]。

1.2.2 白蛋白商值計算公式及結(jié)果判定 利用QA評估BBB完整性功能，即CSF白蛋白與血清白蛋白比率，其中≤7×10-3為正常；介于7×10-3-14×10-3之間為輕度損傷；介于14×10-3-30×10-3為中度損傷；介于30×10-3-100×10-3為重度損傷；>100×10-3為完全破裂[13]。

1.2.3 評估CNS中TM的鞘內(nèi)合成 神經(jīng)系統(tǒng)利用IgG指數(shù)評估鞘內(nèi)合成IgG，其中IgG指數(shù)>0.7提示鞘內(nèi)合成了IgG[10]。本研究中將CSF中TM類比成IgG，計算TM指數(shù)判斷是否存在CSN鞘內(nèi)合成。Q TM即CSF/血清TM，而TM指數(shù)公式為：Q TM/QA。其中TM指數(shù)>0.7，提示CSF中有TM的鞘內(nèi)合成，最后，通過TM指數(shù)定量CSF中TM哪些比例來源于鞘內(nèi)生成，公式如下[8]：

TM鞘內(nèi)=TMCSF-0.7×QA×TMserum，并計算TM鞘內(nèi)與TMCSF百分比。

1.2.4 腦脊液中TM動態(tài)監(jiān)測 經(jīng)Ommaya囊引流CSF是LM一種局部治療的手段，3例（12%）患者顱高壓明顯時予引流CSF減輕顱高壓癥狀。所有患者植入Ommaya囊后行周期性腦室內(nèi)化療，每次在接受腦室內(nèi)化療前留取腦室內(nèi)CSF，完善CSF常規(guī)、生化全體、細胞學(xué)及TM等指標檢測，評估療效。重要步驟：常規(guī)消毒皮膚，用頭皮針插入Ommaya囊內(nèi)，抽出并丟棄囊和管內(nèi)3 mL左右CSF，再緩慢收集5 mL-7 mL的CSF行相關(guān)指標檢測，腦室內(nèi)化療后再次予局部消毒，紗布覆蓋。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布資料計算均數(shù)和標準差，采用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示；計數(shù)資料采用百分數(shù)表示，兩組間比較應(yīng)用方差分析。CSF中TM指數(shù)與TM檢出陽性率之間的一致性分析采用Kappa檢驗，其中Kappa值<0.2表示二者診斷一致性差，0.21-0.40表示二者診斷一致性弱，0.41-0.60表示二者診斷一致性中等，0.61-0.80表示二者診斷一致性較強，0.81-1.00表示二者診斷幾乎相同，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LM組與NMNDs組相關(guān)指標的比較 本實驗組共納入49例，根據(jù)排除標準，最后納入LM組共25例，詳細篩選流程見圖1，均已簽署相關(guān)知情同意書。LM組男性8例，女性17例，年齡為39歲-62歲，平均（52.04±6.61）歲。NMNDs組男性32例，女性25例，年齡36歲-71歲，平均（45.91±6.12）歲。兩組間一般資料無顯著差異，性別、年齡、吸煙史、卡氏體能狀態(tài)（Karnofsky performance status, KPS）評分等相關(guān)指標均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），詳細資料見表1。

圖 1 研究篩選流程圖Fig 1 Study subjects. LM:leptomeningeal metastasis; CSF:cerebrospinal fluid.

表 1 一般資料Tab 1 Baseline characteristics

本研究中，LM組23例（92%）因首發(fā)肺內(nèi)病灶而確診肺癌。11例（44%）確診非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）超過3年后出現(xiàn)LM；另外2例（8%，患者6和患者10）因首發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀確診肺癌（表2）。所有患者病程中都出現(xiàn)至少一個臨床癥狀，其中15例（60%）出現(xiàn)頭痛，14例（56%）肌力受損，10例（40%）顱神經(jīng)障礙，7例（28%）癇性發(fā)作，3例（12%）后背痛，4例（16%）小便失禁。所有患者均在腰椎穿刺前行影像學(xué)檢查，其中16例（64%）MRI提示異常（腦膜異常強化、結(jié)節(jié)等特異性表現(xiàn)），9例（36%）MRI檢查陰性（表2）。

表 2 LM組患者臨床資料Tab 2 The clinical characteristics of LM patients

LM組及NMNDs組所有患者均進行了腰穿，同時評估CSF和血清相關(guān)指標。其中NMNDs組高顱壓人數(shù)超過LM組（84.2% vs 64%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。LM組15例（60%）CSF中查見惡性腫瘤細胞，其中患者18經(jīng)歷兩次腰穿后才獲得CSF陽性。LM組血清及CSF中TM均高于NMNDs組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。圖2可見NMNDs組CSF檢測樣本中，顱內(nèi)壓力值、白細胞計數(shù)、葡萄糖水平高于LM組，蛋白水平低于LM組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），此外，NMNDs血清蛋白水平略高于LM組，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖 2 兩組CSF中白細胞計數(shù)、葡萄糖水平、顱內(nèi)壓（80 cmH2O-180 cmH2O）和白蛋白商值對比Fig 2 The comparison of white blood cell count, glucose, intracranial pressure(80 cmH2O-180 cmH2O) and quotient of albumin in CSF between two groups

2.2 LM組和NMNDs組血腦屏障功能評估 LM患者中94%（24/25）存在BBB障礙（QA>8×10-3），其中輕度、中度、重度和完全血腦屏障受損患者分別為：10例、12例、2例和0例（表3）。LM組15例（60%）患者CSF中找到了惡性腫瘤細胞，其中5例（20%）CSF中血糖濃度降低（參考范圍：2.5 mmol/L-4.5 mmol/L），此外，CSF中白細胞計數(shù)在（3-52）×109/L，平均在（18.9±12.7）×109/L。

表 3 LM患者CSF中葡萄糖、QA、白細胞計數(shù)、腫瘤細胞水平Tab 3 The levels of glucose, QA, white blood cells and tumor cells in CSF for LM patients

NMNDs組CSF細胞學(xué)均未查見惡性腫瘤細胞，其中55例（96.5%）患者BBB功能正常（QA≤7×10-3），另外有2例（3.5%）CSF中檢測到TM濃度高于陽性界值，余患者CSF中TM濃度在正常范圍內(nèi)。

2.3 LM組CSF中TM的鞘內(nèi)合成 LM組接受檢測的CSF樣本中，Q TM與QA比值均大于0.7（圖3），且Q CEA、Q CA125水平高于NMNDs組，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。LM組至少能檢測到一種鞘內(nèi)合成的TM（表4），21例（84%）鞘內(nèi)合成CEA（CEA鞘內(nèi)占CSF中CEA濃度：76.22%-99.99%）；22例（88%）鞘內(nèi)合成CYFRA21-1（CYFRA21-1鞘內(nèi)占CSF中CYFRA21-1濃度：79.24%-99.98%），23例（92%）鞘內(nèi)合成CA125（CA125鞘內(nèi)占CSF中CA125濃度：82.67%-99.98%），23例（92%）鞘內(nèi)合成NSE（NSE鞘內(nèi)占CSF中NSE濃度：88.55%-99.80%）。此外，LM組24例（96%）鞘內(nèi)合成至少2項TM，22例患者（92%）鞘內(nèi)合成至少3項TM，18例患者（72%）鞘內(nèi)合成四項TM。

表 4 LM組患者鞘內(nèi)合成TM（濃度和百分比）Tab 4 TM intrathecal synthesis in LM patients (concentration and percentage)

圖 3 兩組QA和Q TM對比（*P<0.05）Fig 3 The comparison of QA and Q TM between two groups (*P<0.05)

1例患者（患者18），在首次腰椎穿刺后CSF細胞學(xué)檢查陰性，但檢查提示有鞘內(nèi)合成TM（CEA鞘內(nèi)：69.19 ng/mL，占CSF濃度93.42%；CA125鞘內(nèi)：5.99 U/mL，占CSF濃度86.34%；CYFRA21-1鞘內(nèi)：3.33 ng/mL，占CSF濃度98.07%；NSE鞘內(nèi)：8.75 ng/mL，占CSF濃度95.47%），對該患者進行第二次腰穿時，CSF細胞學(xué)陽性，最終明確了LM診斷。

2.4 LM組CSF中TM檢出情況與鞘內(nèi)合成相關(guān)性分析 本研究中所有患者行周期性腦室內(nèi)化療，平均治療4.5個周期，其中64%（16/25）的CSF中TM陽性，CEA陽性在CSF中最常見，占68.8%（11/16），其中CEA單獨陽性共5例，CEA聯(lián)合余三項TM中任一項為陽性共8例，CSF中CEA陰性而余三項中任一項TM陽性共5例。

臨床工作中，常常以CSF中TM濃度輔助診斷LM，將CSF中TM指數(shù)與TM檢出陽性率2種方法進行對比，使用線性加權(quán)Weighted Kappa系數(shù)分析，評估TM指數(shù)與TM檢出陽性率對LM診斷是否具有相關(guān)性，結(jié)果顯示，CEA指數(shù)與檢出陽性率對25例LM患者診斷的陽性一致率為88.9%，陰性一致率為18.2%，一致性檢測Kappa值為0.065；CA125指數(shù)與檢出陽性率診斷的陽性一致率為91.7%，陰性一致率為12.5%，Kappa值0.071；CYFRA21-1指數(shù)與檢出陽性率診斷的陽性一致率為76.9%，陰性一致率為0%，Kappa值為0.06；NSE指數(shù)與檢出陽性率診斷的陽性一致率為66.7%，陰性一致率為5.9%，Kappa值為0.09?？偟膩碚f，CSF中TM指數(shù)與TM陽性界值對LM診斷結(jié)果具有不一致性，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05，表5）。

表 5 LM組TM指數(shù)與CSF中TM檢出率的一致性分析Tab 5 The consistency analysis between TM index and the positive rates of CSF TM in LM group

2.5 動態(tài)監(jiān)測CSF鞘內(nèi)合成TM的臨床價值 所有患者每次行腦室內(nèi)化療前留取同期CSF和血清，計算和記錄CSF中鞘內(nèi)生成TM、細胞數(shù)和QA。其中患者1在治療6個月后，CSF細胞數(shù)變化與白蛋白商值、鞘內(nèi)合成CEA的變化相似，該患者超過2年保持臨床穩(wěn)定（圖4）。

圖 4 1例LM患者經(jīng)Ommaya囊腦室內(nèi)化療過程中，鞘內(nèi)合成CEA，CSF蛋白與血清蛋白比率以及CSF腫瘤細胞數(shù)的動態(tài)變化Fig 4 Intrathecal synthesis CEA fraction (CEAlS), CSF/serum quotient of albumin (QA) and CSF tumor cells in a case of LM patients under intrathecal chemotherapy via Ommaya Reservoirs

3 討論

LM是晚期肺癌致殘和致死的重要原因之一，預(yù)后極差[14]。CSF細胞學(xué)是診斷LM的基石，但診斷敏感性低，尤其是在LM早期，導(dǎo)致治療時機的貽誤[1,6,15]。因此，在CSF中尋找診斷LM敏感性高的指標至關(guān)重要。CSF中TM濃度的升高常常被用于LM的輔助診斷[16]，CSF中TM濃度升高取決于：①局部癌細胞分泌釋放；②血清中TM通過BBB滲入，前一種可能性更大[17]。CSF中TM的診斷LM敏感性低，尤其是在LM疾病早期，臨床應(yīng)用受限，很大程度上因為CSF中TM濃度取決于血清水平和BBB狀態(tài)，因此，相較于檢測TM濃度，判斷CSF中TM的來源對LM診斷同樣具有重要診斷作用。

我們前期通過CSF中TM濃度診斷LM的研究中，發(fā)現(xiàn)部分患者血清TM正常，而CSF中TM升高；也存在患者血清TM和CSF中TM同時升高的現(xiàn)象[18]，提示LM存在鞘內(nèi)TM合成。目前對于CSF中TM升高影響因素的相關(guān)研究較少。Schold等[19]發(fā)現(xiàn)血清CEA濃度升高的卒中患者，BBB破壞后CSF中CEA未見升高。同樣有文獻[9]報道，除非血清TM濃度足夠高，且血清與CSF中CEA濃度比值超過60:1，才能透過BBB滲入CSF中，影響CSF中TM濃度。有文獻[9,11,20,21]報道提出，TM和IgG均為小分子物質(zhì)，分子量相近，血清中TM遵循與IgG濾過BBB相似的擴散定律，可通過IgG指數(shù)公式計算鞘內(nèi)CEA合成，明確鞘內(nèi)CEA來源對CNS疾病進行診斷分類。Kang等[9]分析CEA商值（CSF與血清CEA比值）與白蛋白商值具有相關(guān)性，排除BBB損傷對CSF中CEA濃度的干擾，更好地評估CSF中CEA升高與癌細胞分泌相關(guān)，診斷特異性強。CSF與血清CEA比值正?；蛘呶礄z測到，可能是顱內(nèi)癌細胞未分泌CEA，并不能完全排除LM，且相關(guān)研究入組的是多種實體瘤伴LM（乳腺癌、腸癌、肺癌等），診斷敏感性不高。因此，本研究入組的均為肺癌伴LM，選擇對肺癌診斷敏感性高的4項腫瘤指標，通過分析QA評估BBB的完整性、CSF與血清肺癌4項比值判斷CSF中TM來源，評估LM患者顱內(nèi)TM升高的影響因素，希望為肺癌LM的診斷提供一種全新的診斷方法。

本研究中，利用CNS疾病診斷中重要的計算公式，即IgG指數(shù)，分析比較LM組與對照組鞘內(nèi)TM合成的差異，評估鞘內(nèi)TM合成對LM診斷的敏感性和特異性，為LM的臨床診斷和鑒別診斷提供依據(jù)。本研究數(shù)據(jù)顯示，鞘內(nèi)合成的CEA、CA125、CYFせ21-1、NSE對LM的診斷敏感性分別為84%、88%、92%、92%，特異性高達100%，對照組CSF中未發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)合成TM，而LM組所有CSF中均發(fā)現(xiàn)有鞘內(nèi)TM合成。另外，LM組所有患者至少存在一種鞘內(nèi)TM合成，因此，對疑似LM患者行CSF檢測時，可同時進行CSF中CEA、CA125、CYFRA21-1、NSE的檢測，計算4種TM鞘內(nèi)合成，通過判斷CSF中TM來源診斷LM。研究還發(fā)現(xiàn)，CSF中TM檢測濃度超過76.22%-99.98%來源于鞘內(nèi)合成，且鞘內(nèi)TM合成與CSF中TM檢出情況不一致，因此，對所有行CSF中TM檢測的患者分析鞘內(nèi)合成并定量，明確CSF中TM來源有助于LM的診斷，并成為LM診斷敏感性高和特異性強的有效工具。

本研究中，所有患者在經(jīng)Ommaya腦室內(nèi)化療前收集腦室內(nèi)CSF動態(tài)監(jiān)測TM。有趣的是，患者1在診斷LM時提示有3種TM的鞘內(nèi)合成，經(jīng)過腦室內(nèi)化療2個周期后癥狀明顯緩解，CSF中TM濃度、鞘內(nèi)合成的TM、CSF細胞數(shù)明顯下降，治療6個月后CSF中細胞學(xué)轉(zhuǎn)陰，最終該患者在LM后獲得了2年生存期。由此推測，CSF中鞘內(nèi)合成的TM或許可作為評價LM治療療效的指標之一，接受腦室內(nèi)化療患者CSF中CEA的變化早于CSF細胞學(xué)變化，更早地提示治療療效和預(yù)警復(fù)發(fā)，對于有鞘內(nèi)合成TM的LM患者而言，連續(xù)動態(tài)監(jiān)測TM可能具有臨床應(yīng)用價值，但是因為病例數(shù)少，這個單一的發(fā)現(xiàn)并不能作為結(jié)論，期待后續(xù)有更多的研究數(shù)據(jù)支持TM潛在的應(yīng)用價值。

文獻[22]報道，CSF細胞學(xué)陽性LM患者中50%細胞計數(shù)正常。本研究中，LM組60%患者CSF中均檢測到了癌細胞，8例（32%）CSF中細胞計數(shù)正常，這與文獻報道一致，提示臨床工作中CSF細胞計數(shù)正常，也不能完全排除LM，CSF細胞學(xué)檢測應(yīng)始終作為常規(guī)檢查，一旦懷疑有惡性細胞，應(yīng)對所有CSF標本仔細行細胞形態(tài)學(xué)分析。在CSF細胞學(xué)陰性的情況下，90%的LM患者觀察到CSF間接變化，包括顱內(nèi)壓升高（>200 mmH2O）占21%-42%，白細胞計數(shù)增加（> 4 mm-3）占48%-77%，蛋白質(zhì)升高（>50 mg/dL）占56%-91%，葡萄糖降低（<60 mg/dL）占22%-63%[23]。臨床上，CSF細胞學(xué)陰性但白細胞計數(shù)升高的現(xiàn)象，對鑒別是癌性腦膜炎，還是感染或免疫疾病導(dǎo)致CSF變化帶來了極大困難，尤其是結(jié)核性腦膜炎，無論是臨床癥狀/體征，還是CSF異常均與LM有諸多相似[24]，難以鑒別；另外腫瘤患者發(fā)生LM前往往接受過多線放化療，機體處于免疫抑制狀態(tài)，更易出現(xiàn)CNS感染，如真菌或者其他機會性病原體感染，以上種種原因都會出現(xiàn)顱高壓癥狀、CSF檢查異常[25]，從而導(dǎo)致LM誤診和漏診，耽誤治療時機，因此，對于首次檢測CSF細胞學(xué)陰性，TM檢測以及鞘內(nèi)合成TM計算可進一步提高診斷的敏感性，必要時重復(fù)腰穿行細胞學(xué)檢查，從而避免治療時機貽誤。CSF中葡萄糖濃度低可見于多種感染性疾病，而LM發(fā)生BBB損傷，葡萄糖膜轉(zhuǎn)運受損，血清中葡萄糖向CSF有效運輸降低，也可導(dǎo)致葡萄糖水平下降。據(jù)文獻[26]報道，細菌性腦膜炎患者CSF中葡萄糖濃度低于1 mmol/L，而本研究中20例（80%）LM患者CSF中葡萄糖水平正常，表明CSF中葡萄糖水平對LM的診斷價值有限。

當然，本研究還存在許多不足，該研究為一項單中心、小樣本回顧性研究，對這25例LM患者觀察結(jié)果是初步的，還需要納入更多患者進一步評估并確認這些發(fā)現(xiàn)，以明確CSF中TM的診斷和預(yù)后價值。另外，本研究納入肺腺癌人群，無法探究鞘內(nèi)不同TM合成是否與肺癌不同組織類型相關(guān)。本研究首次納入肺癌來源的LM患者，檢測對肺癌敏感性高的4項TM，嘗試QA和IgG指數(shù)公式，評價BBB完整性，判斷鞘內(nèi)TM來源并使之成為LM診斷的一個特定而敏感的參數(shù)，動態(tài)觀察BBB完整性及鞘內(nèi)TM合成量的演變規(guī)律，也有助于臨床判斷病情、療效及預(yù)后的評估。

Author contributions

Lin YJ conceived and designed the study. Lin YJ and Yu TT performed the experiments. Yu TT, Li HY and Guo AB analyzed the data. Yin ZY contributed analysis tools. Lin YJ, Yuヰ and Guo AB provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.