周靜 王心悅 李兆娜 蔣日成

肺癌是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其5年生存率約為15%。非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的75%-80%。其中，肺腺癌是非吸煙者和女性中最常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌亞型，其危險(xiǎn)因素主要包括二手煙、污染和職業(yè)致癌物，并具有遺傳易感性[1]。盡管肺癌在化療和靶向治療方面已取得了很大的進(jìn)展，但大多數(shù)患者的總生存率仍較低。其主要原因之一是大多數(shù)患者診斷時(shí)已處于晚期階段。目前臨床上常用的預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后的指標(biāo)包括腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況和突變負(fù)荷等，但腫瘤存在高度的異質(zhì)性，即使腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis, TNM）分期相同的患者，其治療效果和預(yù)后仍有很大差別，單純依靠上述指標(biāo)有時(shí)并不能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后，特異性欠佳。因此，我們需要探索新的生物標(biāo)志物，可以輔助上述常用的預(yù)測(cè)指標(biāo)，可靠的評(píng)估腫瘤患者預(yù)后和生存情況，為肺腺癌個(gè)體化診療提供依據(jù)。

自噬是由一系列ARGs調(diào)控的多步驟的溶酶體降解過(guò)程，已被廣泛證實(shí)可參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[2]。大量研究表明，自噬在腫瘤的發(fā)生和治療中是一把雙刃劍。一方面，自噬可在細(xì)胞癌變前降解受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)而發(fā)揮抑癌作用；另一方面，自噬可促進(jìn)細(xì)胞代謝物質(zhì)循環(huán)，滿足細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)需求，故在腫瘤發(fā)生晚期，自噬可為腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲提供能量和營(yíng)養(yǎng)，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐受[3]。已有許多研究[4,5]表明，自噬與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如自噬相關(guān)基因10（ATG10）的過(guò)表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后有關(guān)。盡管自噬在腫瘤治療中的作用仍有爭(zhēng)議，但已有證據(jù)[6,7]表明，自噬是LUAD放化療過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)控因子。

近幾年，基于多個(gè)基因所構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型已被廣泛研究并用于預(yù)測(cè)各種腫瘤的預(yù)后，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等，在某些癌種中，其預(yù)后預(yù)測(cè)性能甚至優(yōu)于組織病理學(xué)診斷和腫瘤分期[8,9]。本研究利用生物信息學(xué)，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選對(duì)肺腺癌有預(yù)后價(jià)值的自噬相關(guān)基因，通過(guò)LASSO和Cox回歸分析最終構(gòu)建了由5個(gè)ARGs組成的肺腺癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，評(píng)估模型的預(yù)測(cè)性能，確定模型的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值和臨床相關(guān)性，為肺腺癌患者的個(gè)體化診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中檢索“Autophagy”獲得5,128個(gè)自噬相關(guān)基因。于2021年1月31日從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載了全部的肺腺癌的3級(jí)RNA測(cè)序（RNA-Seq）數(shù)據(jù)。同時(shí)，從UCSC Xena網(wǎng)站（https://xenabrowser.net/）收集了這些患者相應(yīng)的臨床信息［包括性別、年齡、腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變、ALK基因融合、KせS基因突變、生存時(shí)間及生存狀態(tài)］。排除臨床信息不完整的樣本后，共納入395例LUAD樣本和48例正常樣本。從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus database, GEO）下載數(shù)據(jù)集GSE31210和GSE72094作為基因驗(yàn)證集。本研究中，所有數(shù)據(jù)集均來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)，無(wú)需倫理批準(zhǔn)。

1.2 ARGs的差異表達(dá)分析和功能富集分析 利用R-4.0.3軟件中的“l(fā)imma”包篩選LUAD與正常肺組織間差異表達(dá)的ARGs，利用“edgeR”包對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤率（false discovery rate,FDR）<0.05和|log2(Fold Change)|>2。使用“ggplot2”和“pheatmap”包繪制火山圖和熱圖用于差異基因的可視化。通過(guò)生存分析確定差異表達(dá)ARGs與總生存期（overall survival, OS）的關(guān)系，設(shè)置閾值為P<0.05，初步篩選對(duì)肺腺癌有預(yù)后價(jià)值的差異表達(dá)自噬基因。利用R軟件的“clusterProfiler”和“enrichplot”等包對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體功能（Gene Ontology, GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway, KEGG）分析及可視化，以探討有預(yù)后價(jià)值的差異表達(dá)ARGs的潛在分子機(jī)制。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型 通過(guò)log2（x+1）轉(zhuǎn)換對(duì)RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將差異表達(dá)ARGs的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)量與LUAD樣本生存信息合并，去除無(wú)生存時(shí)間記錄的患者后，共381例LUAD樣本納入Cox回歸分析。對(duì)有預(yù)后價(jià)值的ARGs進(jìn)行單因素Cox回歸分析、LASSO回歸和多因素Cox回歸分析并繪制森林圖。LASSO回歸可減少基因之間的共線性影響，降低后續(xù)所構(gòu)建模型基因的過(guò)度擬合。在R軟件中加載“glmnet”包，對(duì)經(jīng)單因素Cox分析所獲得的預(yù)后相關(guān)ARGs進(jìn)行LASSO回歸分析，將回歸系數(shù)不為0的基因再納入多因素Cox分析，構(gòu)建最終的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（RiskScore）計(jì)算公式為：RiskScore=基因表達(dá)量1×Coef1+基因表達(dá)量2×Coef2+…+基因表達(dá)量n×Coefn（Coef：基因在多因素Cox回歸分析中的回歸系數(shù)，n：與預(yù)后相關(guān)ARGs總數(shù)目）。根據(jù)公式計(jì)算每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，利用R軟件的“pROC”包繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic, ROC）曲線計(jì)算約登指數(shù)（Youden index），以確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的最佳截?cái)啵╟ut-off）值。以cut-off值為截?cái)嘀祵⒎蜗侔┗颊叻譃楦唢L(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組。

1.4 評(píng)價(jià)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型 加載R軟件“survival”包，根據(jù)上述分組繪制高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布曲線、生存情況分布圖及建?；虮磉_(dá)量熱圖。同時(shí)，利用R軟件的“survminer”包繪制Kaplan-Meier生存曲線對(duì)兩組的OS進(jìn)行生存分析比較。應(yīng)用“timeROC”包繪制時(shí)間依賴性ROC曲線，分別計(jì)算樣本OS在1年、2年、3年、5年、7年的AUC，從而評(píng)估模型預(yù)測(cè)預(yù)后的能力，AUC越高代表模型性能越好。

1.5 模型獨(dú)立預(yù)后及臨床特征相關(guān)性分析 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析，以確定模型是否具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。若風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與OS在單因素和多因素Cox分析中均呈現(xiàn)顯著差異，則說(shuō)明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。將通過(guò)單因素和多因素分析識(shí)別出的獨(dú)立危險(xiǎn)因素作為變量，加載“rms”包，繪制列線圖，用以推測(cè)患者未來(lái)的生存率。同時(shí)，分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否對(duì)不同臨床特征患者的預(yù)后也具有預(yù)測(cè)性能。

1.6 驗(yàn)證預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)選取GSE31210和GSE72094作為外部驗(yàn)證集，根據(jù)上述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，計(jì)算驗(yàn)證集中每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。同樣地，利用ROC曲線，確定兩個(gè)數(shù)據(jù)集各自風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的最佳cut-off值，進(jìn)行高、低風(fēng)險(xiǎn)分組，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線對(duì)兩組的OS進(jìn)行比較，AUC評(píng)估模型預(yù)測(cè)預(yù)后的能力，以驗(yàn)證預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)性能。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)自噬基因的篩選及功能富集分析 從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集5,786個(gè)自噬相關(guān)基因。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共收集395個(gè)肺腺癌組織和48個(gè)正常組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。提取5,786個(gè)ARGs的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以FDR<0.05和|log2(Fold Change)|>2為閾值，在肺腺癌與正常肺組織中共篩選出361個(gè)差異表達(dá)的ARGs，包括275個(gè)上調(diào)基因和86個(gè)下調(diào)基因，差異基因可視化結(jié)果如圖1A、圖1B所示。對(duì)上述361個(gè)差異基因進(jìn)行生存分析，篩選出52個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的ARGs（P<0.05）。對(duì)52個(gè)有預(yù)后價(jià)值的差異表達(dá)ARGs進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析，GO功能富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)ARGs主要富集在調(diào)控染色體分離、調(diào)控受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、調(diào)控細(xì)胞周期和調(diào)控自噬等（P<0.05，圖2A）；KEGG信號(hào)通路主要富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞因子受體相互作用、IL-17信號(hào)通路、自噬、HIF-1信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等（P<0.05，圖2B）。

圖 1 自噬相關(guān)基因的差異分析。A：差異表達(dá)基因火山圖（275個(gè)上調(diào)基因和86個(gè)下調(diào)基因）；B：差異表達(dá)基因表達(dá)熱圖。Fig 1 Differential analysis of autophagy related genes. A: Volcano plot of differentially expressed genes (275 up-regulated genes and 86 down-regulated genes); B: Heat map of differentially expressed genes.

圖 2 功能富集分析和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的構(gòu)建。A：GO富集分析；B：KEGG通路富集分析；C：?jiǎn)我蛩谻ox回歸分析結(jié)果森林圖；D：LASSO分析；E：多因素Cox回歸分析結(jié)果森林圖。Fig 2 Functional enrichment analysis and construction of prognostic risk score model. A: GO enrichment analysis; B: KEGG pathway enrichment analysis; C: The forest plots of univariate Cox regression analysis; D: LASSO analysis; E: The forest plot of multivariate Cox regression analysis results.GO: Gene Ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway.

2.2 Cox分析及風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建 對(duì)52個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的ARGs進(jìn)行單因素Cox分析，得到7個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的自噬基因ADAM12、CAMP、DKK1、FAM83A、GJB2、STRIP2和TFAP2A（P<0.05，圖2C）。對(duì)上述7個(gè)ARGs進(jìn)行LASSO回歸分析識(shí)別更穩(wěn)定的基因，虛線標(biāo)注處為logλ最小值，該處對(duì)應(yīng)的基因?yàn)樽罴呀；?，LASSO回歸系數(shù)均不為0，如圖2D所示，虛線右側(cè)為篩選出可作為最佳建?；虻?個(gè)穩(wěn)定基因。經(jīng)進(jìn)一步多因素Cox回歸分析，我們最終得到5個(gè)與肺腺癌預(yù)后顯著相關(guān)的自噬基因，構(gòu)成了肺腺癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，分別是ADAM12（ADAM metallopeptidase domain 12,Coef=0.042）、CAMP（Cathelicidin Antimicrobial Peptide,Coef=-0.081）、DKK1（Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor 1, Coef=0.036）、STRIP2（striatin interacting protein 2, Coef=0.027）和TFAP2A（transcription factor AP-2 Alpha,Coef=0.039）（圖2E）。其中CAMP的風(fēng)險(xiǎn)比（hazar ratio, HR）<1，提示低表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；ADAM12、DKK1、STRIP2和TFAP2A的HR>1，提示高表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，5個(gè)基因的生存分析如圖3A-圖3E所示。根據(jù)5個(gè)ARGs的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)和mRNA表達(dá)量計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（RiskScore）計(jì)算公式為：（0.042* ADAM12表達(dá)量）+（-0.081* CAMP表達(dá)量）+（0.036* DKK1表達(dá)量）+（0.027* STRIP2表達(dá)量）+（0.039* TFAP2A表達(dá)量）。

圖 3 5個(gè)建?；虻纳娣治?。A：ADAM12的生存曲線；B：CAMP的生存曲線；C：DKK1的生存曲線；D：STRIP2的生存曲線；E：TFAP2A的生存曲線。Fig 3 Survival analysis of 5 signature genes. A: The survival curve of ADAM12; B: The survival curve of CAMP; C: The survival curve of DKK1; D: The survival curve of STRIP2; E: The survival curve of TFAP2A.

2.3 風(fēng)險(xiǎn)模型性能評(píng)價(jià) 根據(jù)5個(gè)ARGs的表達(dá)量及回歸系數(shù)計(jì)算出每個(gè)肺腺癌樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，繪制ROC曲線得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的最佳cut-off值為1.057，以此將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（N=154）和低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（N=227）。可視化分析結(jié)果顯示，紅色代表高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組，藍(lán)色代表低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組（圖4A）。高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組患者死亡比例較低風(fēng)險(xiǎn)組更高，說(shuō)明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組更易具有不良預(yù)后（圖4B）。ADAM12、DKK1、STRIP2和TFAP2A在高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組高表達(dá)，提示高表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)；CAMP在高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組低表達(dá)，提示低表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)（圖4C），與圖3A-圖3E生存分析結(jié)果一致。Kaplan-Meier生存曲線表明，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者OS明顯較低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者低，二者OS有顯著差異（P<0.000,1，圖4D）。時(shí)間依賴性ROC曲線結(jié)果如圖4E所示，1年時(shí)間AUC為0.78，2年AUC為0.71，3年時(shí)間AUC為0.67，5年時(shí)間AUC為0.62，7年時(shí)間AUC為0.65。上述評(píng)價(jià)結(jié)果表明，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)肺腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)有較好的敏感性和特異性。

圖 4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的性能評(píng)估。A：風(fēng)險(xiǎn)曲線；B：生存狀態(tài)圖；C：建?；虮磉_(dá)熱圖；D：Kaplan-Meier生存曲線；E：時(shí)間ROC曲線。Fig 4 Performance evaluation of prognostic risk score model. A: Risk curve; B: The survival status chart; C: The heatmap of the five signature genes expression profiles; D: Kaplan-Meier survival curve; E: Time ROC curve.

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果均呈現(xiàn)顯著差異，說(shuō)明風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，可作為L(zhǎng)UAD患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子。將年齡、性別、腫瘤分期、EGFR基因突變、ALK基因融合、KRAS基因突變和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為變量納入單因素和多因素Cox回歸分析。單因素Cox分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤分期是LUAD患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素（P<0.05，圖5A）。再將上述2個(gè)危險(xiǎn)因素納入多變量Cox分析，結(jié)果顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和腫瘤分期均是LUAD患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素（P<0.05，圖5B）。Nomogram圖得分可用于推測(cè)患者未來(lái)1年、3年、5年的生存率（圖5C）。

圖 5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。A：?jiǎn)我蛩谻ox獨(dú)立預(yù)后分析；B：多因素Cox獨(dú)立預(yù)后分析；C：Nomogram圖。Fig 5 Independent prognostic value of prognostic risk scoring models. A: Univariate Cox independent prognostic analysis; B: Multivariate Cox independent prognostic analysis; C: Nomogram plot.

2.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征相關(guān)性 我們利用TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究該模型是否對(duì)不同臨床特征患者的預(yù)后也具有預(yù)測(cè)性能，包括性別、年齡、腫瘤大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、EGFR基因突變、ALK基因融合、KRAS基因突變和生存狀態(tài)。分析結(jié)果：T3期-T4期患者較T1-T2期患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高且兩組之間存在顯著差異（P<0.05，圖6C）；T3期-T4期腫瘤患者較T1期-T2期腫瘤))))患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高且兩組之間存在顯著差異（P<0.05，圖6B）；死亡患者較生存患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高且兩組之間存在顯著差異（P<0.001，圖6A）；而在不同性別、不同年齡階段、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)EGFR基因突變、有無(wú)ALK基因融合，及有無(wú)KRAS基因突變患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分未出現(xiàn)顯著差異。上述結(jié)果說(shuō)明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與T分期、腫瘤分期和發(fā)生不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖 6 臨床相關(guān)性分析。A：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存狀態(tài)的臨床相關(guān)性；B：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與腫瘤分期的臨床相關(guān)性；C：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與T分期的臨床相關(guān)性。*P<0.05，***P<0.001。Fig 6 Clinical characteristic correlation analysis. A: The clinical correlation between risk score and survival status; B: The clinical correlation between risk score and tumor stage; C: The clinical association between risk score and T staging. *P<0.05, ***P<0.001.

2.6 外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證模型 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選取GSE31210和GSE72094數(shù)據(jù)集及作為外部驗(yàn)證集。GSE31210和GSE72094數(shù)據(jù)集的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分cut-off值分別為0.878和1.009，上述兩個(gè)驗(yàn)證集的Kaplan-Meier生存曲線均表明，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者OS較低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者更低，二者OS有顯著差異（圖7B，P=0.014；圖7D，P<0.000,1）。兩個(gè)驗(yàn)證集的1年-5年AUC值在0.61-0.88，說(shuō)明該模型在外部驗(yàn)證集中仍具有較好的預(yù)測(cè)性能（圖7A，圖7C）。

圖 7 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在外部驗(yàn)證集中的性能評(píng)估。A：GSE31210的時(shí)間ROC曲線；B：GSE31210的Kaplan-Meier生存曲線；C：GSE72094的時(shí)間ROC曲線；D：GSE72094的Kaplan-Meier生存曲線。Fig 7 Performance evaluation of prognostic risk score model in external validation sets. A: Time ROC curve of GSE31210; B: Kaplan-Meier survival curve of GSE31210; C: The time ROC curve of GSE72094; D: Kaplan-Meier survival curve of GSE72094.

3 討論

研究[10]表明自噬參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，可以滿足腫瘤細(xì)胞高代謝的需求，在腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲中發(fā)揮重要作用。自噬是肺腺癌治療過(guò)程中耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子，抑制自噬可激活EGFR突變從而提高Afatinib在肺腺癌中的抗腫瘤活性[11]。抑制自噬還可以提高Shh抑制劑vismodegib對(duì)LUAD的療效[12]。

本研究通過(guò)GeneCard數(shù)據(jù)庫(kù)收集ARGs，利用來(lái)自TCGA的肺腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)和生存信息，篩選出52個(gè)有預(yù)后價(jià)值的ARGs，經(jīng)GO和KEGG富集分析提示這些基因主要富集在調(diào)控細(xì)胞周期、參與自噬、參與HIF-1信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等功能。通過(guò)單因素Cox回歸分析、LASSO回歸和多因素Cox回歸分析篩選出5個(gè)關(guān)鍵ARGs（ADAM12、CAMP、DKK1、STRIP2和TFAP2A），構(gòu)建了肺腺癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。ADAM12的分泌形式在肺癌中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。沉默ADAM12可通過(guò)激活人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。抑制ADAM12可降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。CAMP是體內(nèi)的一種宿主免疫肽，具有抗腫瘤作用。CAMP的C端肽LL-37是體內(nèi)唯一的抗菌肽，在細(xì)胞趨化、血管生成、免疫介質(zhì)誘導(dǎo)和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[15]。有研究[16,17]發(fā)現(xiàn)，LL-37在正常結(jié)腸黏膜中表達(dá)強(qiáng)烈，在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，LL-37可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和自噬性死亡，具有獨(dú)特的抗腫瘤發(fā)生作用。DKK1是Wnt信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，是β-catenin/TCF通路的一個(gè)靶點(diǎn)，DDK1可通過(guò)抑制Wnt-CTNNB1信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬[18,19]。STRIP2可調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。STRIP2在肺腺癌中高表達(dá)，通過(guò)調(diào)控AKT/mTOR通路和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肺腫瘤的增殖和侵襲[20]。TFAP2A在多種癌癥中均異常表達(dá)，例如，TFAP2A在人鼻咽癌中過(guò)表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α介導(dǎo)的VEGF/PEDF信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[21]。既往研究[22]發(fā)現(xiàn)TFAP2A可誘導(dǎo)KRT16過(guò)表達(dá)，通過(guò)EMT促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

上述5個(gè)風(fēng)險(xiǎn)ARGs的生存分析和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布圖提示，CAMP基因低表達(dá)和ADAM12、DKK1、STRIP2、TFAP2A基因高表達(dá)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高，更易發(fā)生預(yù)后不良（P<0.05）。通過(guò)繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布、Kaplan-Meier生存曲線證明高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者的預(yù)后更差，1年、2年、3年、5年和7年時(shí)間AUC證明模型對(duì)肺腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)有較好的敏感性和特異性，并在外部數(shù)據(jù)集GSE31210和GSE72094得到驗(yàn)證，證明模型的預(yù)測(cè)性能具有一定的準(zhǔn)確性。同時(shí)，我們還對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行了單因素和多因素Cox回歸分析，證明了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值，可作為L(zhǎng)UAD患者的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子。TNM分期是國(guó)際公認(rèn)的臨床預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，盡管從單因素和多因素Cox分析上看風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（P<0.001）較腫瘤分期（P=0.018）更有優(yōu)勢(shì)，但尚不能說(shuō)明本模型一定優(yōu)于TNM分期的預(yù)測(cè)能力。因?yàn)楸灸Ｐ蜕刑幱诔醪浇㈦A段，且為回顧性研究，樣本量較少，仍需要大規(guī)模的前瞻性臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證其預(yù)測(cè)能力是否較TNM分期更好。待完善基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)后，未來(lái)在臨床應(yīng)用中或可與TNM分期聯(lián)合應(yīng)用于肺腺癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征相關(guān)性分析結(jié)果提示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高低與T分期、腫瘤分期和發(fā)生不良預(yù)后密切相關(guān)，但它們之間的因果關(guān)系仍需進(jìn)一步探索。同時(shí)，有無(wú)EGFR、ALK、KRAS基因突變，在單因素和多因素Cox 回歸分析，以及與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析中均未呈現(xiàn)顯著差異，此結(jié)果可能與臨床中的觀察并不吻合。分析其原因，可能為包含基因突變信息的樣本量較少所導(dǎo)致。

綜上所述，本研究通過(guò)LASSO和Cox回歸分析構(gòu)建了基于自噬相關(guān)基因組肺腺癌的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，該模型的預(yù)測(cè)性能穩(wěn)定，具有的獨(dú)立預(yù)后價(jià)值和臨床相關(guān)性，可輔助為L(zhǎng)UAD患者的個(gè)體化診療提供參考。與同類(lèi)研究相比，本研究的LUAD預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型存在如下特點(diǎn)：首先，許多同類(lèi)研究是以免疫為背景，構(gòu)建免疫相關(guān)基因（immune related genes, IRGs）風(fēng)險(xiǎn)模型以預(yù)測(cè)LUAD患者的預(yù)后[23,24]。然而，很少有預(yù)測(cè)模型以ARGs為基礎(chǔ)構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型。許多ARGs可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，腫瘤組織中ARGs的表達(dá)情況在預(yù)測(cè)生存預(yù)后方面具有很大的前景，這些ARGs可作為新的分子靶點(diǎn)。因此，本研究以自噬為背景，篩選與預(yù)后顯著相關(guān)的ARGs，并構(gòu)建了包含多個(gè)ARGs的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型來(lái)預(yù)測(cè)LUAD患者的生存預(yù)后。同時(shí)，用于建模的風(fēng)險(xiǎn)基因也可作為L(zhǎng)UAD基礎(chǔ)研究和潛在的治療靶點(diǎn)。因此，本研究補(bǔ)充了ARGs風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在LUAD中的研究空白，以實(shí)現(xiàn)對(duì)LUAD患者更精準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)估，為其個(gè)性化治療提供重要參考。其次，本研究通過(guò)2個(gè)外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證所構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型的可靠性。通過(guò)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)測(cè)效能驗(yàn)證（AUC均值>0.600），證明該模型在其他獨(dú)立數(shù)據(jù)集中也具有中等程度的預(yù)測(cè)性能，而上述前人研究中并未在多個(gè)數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗(yàn)證。遺憾的是，我們的研究仍存在一些局限性。首先，本研究中分析的所有數(shù)據(jù)均來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)，所構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型仍需大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以評(píng)估其預(yù)測(cè)效能；其次，本研究用于建模的風(fēng)險(xiǎn)基因尚缺少體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

Author contributions

Zhou J conceived and designed the study. Li ZN collected the data. Zhou J and Wang XY performed the bioinformatics analysis. Zhou J, Li ZN and Wang XY wrote the manuscript. Jiang RC provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.