陳美玲，黃亞軍，姜德建，王小青（湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司，長(zhǎng)沙 410331）

肺部給藥也稱吸入給藥，是指運(yùn)用特殊的裝置，將藥物通過(guò)呼吸運(yùn)輸至肺部，發(fā)揮局部或全身作用的一種給藥方式[1-2]。與其他給藥途徑比較，因肺泡表面積大，膜通透性高，肺部酶活性低，肺吸入制劑藥代動(dòng)力學(xué)（pharmacokinetic，PK）具有以下特征：① 藥物吸收迅速，無(wú)肝臟首過(guò)效應(yīng)；② 藥物在非靶器官的分布較低，可減少或避免藥物對(duì)機(jī)體的毒副反應(yīng)[3-7]。近年來(lái)，隨著肺吸入制劑的快速發(fā)展，針對(duì)肺吸入制劑PK 研究的評(píng)價(jià)方法和手段也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。本文結(jié)合目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，對(duì)肺吸入制劑非臨床PK 研究的一般策略進(jìn)行綜述，為肺吸入制劑的研究開(kāi)發(fā)提供支持。

1 肺吸入制劑非臨床PK 研究的一般考慮

常用的肺吸入制劑主要包括定量吸入劑、干粉吸入劑、霧化吸入劑等[8-9]。定量吸入劑又稱氣霧劑，是指將藥物與拋射劑裝于耐壓密閉容器中，借拋射劑將內(nèi)容物噴出使用的制劑；干粉吸入劑又稱粉霧劑，是指將藥物或與載體的混合物置于吸入裝置內(nèi)，通過(guò)患者自主吸入的一種制劑；霧化吸入劑又稱噴霧劑，是指將藥物或與輔料置于特制裝置中，借助手動(dòng)泵壓力、高壓氣體或超聲振動(dòng)將內(nèi)容物釋出使用的制劑。

與常規(guī)制劑不同的是，肺吸入制劑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)主要有兩條途徑：第一條為部分藥物經(jīng)肺部吸入后，經(jīng)過(guò)黏液層、上皮細(xì)胞、基底膜、間質(zhì)組織吸收入血；第二條為其余部分藥物沉積于口腔，通過(guò)吞咽至胃腸道吸收入血。藥物在肺部吸收的方式包括被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)、淋巴細(xì)胞吞噬等，一般來(lái)說(shuō)，藥物霧化后的粒徑大小和理化性質(zhì)對(duì)吸收方式及吸收部位有較大影響，如脂溶性較大的藥物吸收方式主要為被動(dòng)擴(kuò)散[10-11]。

對(duì)于治療肺部疾病的肺吸入制劑，其有效性主要取決于沉積在肺部的藥物量，而其安全性需要考慮兩個(gè)方面，包括局部安全性和全身安全性。由于肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達(dá)模式也不同，因此需要特別關(guān)注藥物在肺部代謝物的暴露量、藥物間的相互作用、以及藥物是否可被肺部代謝酶活化等，以更好地評(píng)估其治療效果或毒性反應(yīng)。

2 肺吸入制劑非臨床PK 研究的關(guān)注點(diǎn)

2.1 動(dòng)物種屬的選擇

肺吸入制劑的非臨床PK 研究一般采用健康、成年的動(dòng)物進(jìn)行。在考慮與人體PK 性質(zhì)相關(guān)性的前提下，盡可能選擇與毒理學(xué)和藥效學(xué)研究相同的動(dòng)物。創(chuàng)新性藥物應(yīng)選用兩種或兩種以上的動(dòng)物，其中一種為嚙齒類動(dòng)物，另一種為非嚙齒類動(dòng)物。其他藥物，可選用一種動(dòng)物，建議首選非嚙齒類動(dòng)物。大鼠是肺吸入制劑非臨床PK 研究中最常用的動(dòng)物，尤其在研發(fā)初期，可用于候選藥物的篩選、劑量設(shè)計(jì)等。例如，孫杰等[12]利用大鼠考察吸入與注射給予妥布霉素后體內(nèi)藥物的分布情況及毒性反應(yīng)。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如食蟹猴）因其與人類在免疫學(xué)和解剖學(xué)上的相似性，也被用于開(kāi)展一些特殊吸入制劑（如生物大分子）的非臨床PK 研究。有研究顯示，與嚙齒類動(dòng)物相比，獼猴吸入給予西妥昔單抗時(shí)生物利用度更低[12-13]。此外，小鼠、兔等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也可用于肺吸入制劑的非臨床PK 研究。

2.2 給藥準(zhǔn)確性的監(jiān)測(cè)

為了確保在吸入給藥時(shí)遞送藥物的準(zhǔn)確性，在給藥期間需對(duì)藥物遞送劑量、遞送均一性和穩(wěn)定性及空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)[14-20]。在非臨床研究階段，通常在正式給藥前需對(duì)霧化生成方法及含量檢測(cè)方法進(jìn)行考察和驗(yàn)證。

2.2.1 遞送劑量的監(jiān)測(cè)[21-24]肺吸入制劑的非臨床PK 研究通常采用吸入染毒暴露系統(tǒng)進(jìn)行。對(duì)吸入染毒系統(tǒng)進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，調(diào)整氣溶膠流量及稀釋氣流量，可霧化產(chǎn)生不同濃度的藥物顆粒。通過(guò)采樣瓶或合適的濾膜采集一定時(shí)間內(nèi)任意霧化通道霧化后的氣溶膠顆粒（一般連續(xù)多次采集）并通過(guò)高效液相色譜儀等方法檢測(cè)采樣瓶或?yàn)V膜中的藥物濃度，換算成氣溶膠中的藥物濃度，即可獲得一定霧化時(shí)間內(nèi)的藥物劑量。對(duì)于液體制劑（氣霧劑和噴霧劑），通常采用高效液相色譜法、氣相色譜法等方法檢測(cè)有效成分的含量。對(duì)于無(wú)揮發(fā)性的單一化合物，可采用稱重法進(jìn)行氣溶膠濃度的檢測(cè)。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）對(duì)液體和固體型氣溶膠濃度的允許偏差為±20%[13]。

2.2.2 遞送穩(wěn)定性和均一性的考察 肺吸入制劑在吸入染毒系統(tǒng)持續(xù)霧化一定時(shí)間后，通過(guò)間斷采樣和檢測(cè)，可考察持續(xù)霧化的穩(wěn)定性。通過(guò)對(duì)霧化通道進(jìn)行分通道采樣，采集多個(gè)通道的樣品進(jìn)行檢測(cè)，可考察各霧化通道間的均一性。對(duì)于多層的小動(dòng)物單濃度口鼻動(dòng)態(tài)暴露吸入染毒系統(tǒng)，還需對(duì)各層霧化通道進(jìn)行分通道采樣和檢測(cè)，以考察各層霧化通道間的均一性。霧化后各時(shí)間點(diǎn)和各通道的藥物濃度均應(yīng)在目標(biāo)濃度的±20%范圍內(nèi)。

2.2.3 空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布的監(jiān)測(cè) 氣溶膠中藥物顆粒的粒徑分布是影響藥物在呼吸道和肺部沉積的關(guān)鍵參數(shù)，因此，空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布是給藥過(guò)程中質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一。測(cè)試方法主要有碰撞法、激光衍射法和飛行時(shí)間粒徑分析法，前兩種方法較為常用[25]。臨床上，F(xiàn)DA 建議采用至少兩種原理的檢測(cè)方法進(jìn)行空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布的研究，且其中一種必須采用多級(jí)碰撞法。碰撞法是目前吸入制劑體外粒度分析最經(jīng)典的方法，也是美國(guó)和歐洲藥典評(píng)價(jià)吸入制劑體外粒度分布推薦使用的方法。比如《中國(guó)藥典》收載的雙層液體碰撞器，美國(guó)、歐洲藥典收載的Andersen 多級(jí)撞擊器、Marple miler 多級(jí)撞擊器等。近年來(lái)，新一代多級(jí)慣性碰撞器使用普遍，質(zhì)量中值空氣動(dòng)力學(xué)直徑和標(biāo)準(zhǔn)偏差等常用來(lái)作為評(píng)價(jià)參數(shù)。

2.3 體內(nèi)暴露量的檢測(cè)

生物樣品的分析方法包括色譜法、免疫學(xué)法、放射性同位素標(biāo)記法和微生物學(xué)方法等。其中色譜法包括高效液相色譜法、氣相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；免疫學(xué)法包括放射免疫分析法、熒光免疫分析法、酶免疫分析法等。由于生物樣本藥物濃度低、樣品量少、內(nèi)源性物質(zhì)干擾多且個(gè)體差異大，應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)、生物樣品中藥物的濃度選擇不同的檢測(cè)方法。

進(jìn)行組織分布研究時(shí)，除采集心、肝、脾、腎、腦等主要組織器官外，還需關(guān)注呼吸系統(tǒng)組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會(huì)厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中藥物的分布。胡文晉等[26]在研究霧化吸入羥基喜樹(shù)堿后藥物在肺癌小鼠中的組織分布中發(fā)現(xiàn)，肝臟、心臟、腎臟在給藥30 min 后總堿藥物達(dá)到峰值，其中肝內(nèi)濃度最高，而腎和心的總堿分別占肝內(nèi)峰濃度的33.8%和74.2%。

在血漿PK 和組織分布的研究中也會(huì)廣泛運(yùn)用到微透析技術(shù)，不僅可以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的剖殺，而且微透析的樣品無(wú)需勻漿，樣品中不含大分子物質(zhì)，無(wú)需前處理，可極大地節(jié)約時(shí)間成本[27-28]。例如，任亞超[28]在鹽酸氨溴索干粉吸入劑的研究中利用微透析技術(shù)得出鹽酸氨溴索干粉吸入劑能被運(yùn)輸?shù)桨胁课?，與靜脈給藥相比，可達(dá)到更高的局部活性、持續(xù)更長(zhǎng)的時(shí)間。

在進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算時(shí)，因?yàn)槲胫苿┙o藥途徑特殊，需先按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量計(jì)算每分鐘通氣量RMV＝0.608m0.852（m是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量，單位為kg），再計(jì)算實(shí)際給藥劑量D＝（給藥時(shí)長(zhǎng)×氣溶膠中藥物濃度×通氣量×IF）/平均體質(zhì)量（IF為可吸入顆粒的百分?jǐn)?shù)，當(dāng)氣溶膠中有90%以上的顆粒粒徑小于7 μm 時(shí)，IF＝1），最后用實(shí)際給藥劑量計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[29]。常見(jiàn)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)匯總

3 體外PK 研究方法的應(yīng)用

整體動(dòng)物PK 研究固然能較為全面、系統(tǒng)地對(duì)肺吸入制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，但其需要配套的動(dòng)物設(shè)施設(shè)備、吸入染毒系統(tǒng)，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。在研發(fā)早期或因條件受限，無(wú)法開(kāi)展系統(tǒng)的非臨床PK 研究的情況下，研究者們也會(huì)運(yùn)用體外方法進(jìn)行研究。

3.1 離體臟器的應(yīng)用

在研究相關(guān)機(jī)制時(shí)，更多地會(huì)采用動(dòng)物離體臟器。例如，Eriksson 等[30]利用大鼠離體肺單向灌注模型（IPRL）研究沙丁胺醇、沙美特羅等十余種藥物的離體滲透性，采用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)建立生理吸收模型，并與體外細(xì)胞模型結(jié)合，經(jīng)校正后用于預(yù)測(cè)藥物肺部吸收。此外，在研究藥物肺部滲透能力時(shí)，也會(huì)用到蟾蜍。例如，Chen等[31]利用離體蟾蜍肺構(gòu)建給藥池-肺-接收池模型，研究脂質(zhì)體的滲透能力。

3.2 酶系的應(yīng)用

肺部藥物代謝酶主要分布在Ⅱ型細(xì)胞中，種類齊全，含量低，主要是細(xì)胞色素P450（CYP），其大部分位于Clara 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且具有底物特異性[32]。肺部藥物代謝與肝腸代謝存在較大差異，肺部酶活性普遍較低，且表達(dá)模式也不同。肺部常見(jiàn)的CYP 酶為CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1、CYP2J2、CYP3A5 和CYP1A1，而肝臟中常見(jiàn)的CYP 酶為CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6與CYP3A4。比如，CYP3A4 在肝臟中活性最高，而在肺組織較低。同時(shí)，因?yàn)榉尾康拇x能力低，局部代謝產(chǎn)物難清除，新藥研究過(guò)程中需關(guān)注肺部局部代謝物之間的毒性風(fēng)險(xiǎn)和相互作用，如可利用肺S9 篩選候選藥物。肺部代謝酶還可活化部分藥物，使其治療效果更佳，如肺部酯酶可將丙酸倍氯米松代謝為更有效的17-倍氯米松單丙酸酯[33]。

3.3 細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用

Calu-3 細(xì)胞是一種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可形成極化的單層細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞之間形成緊密連接，具有分泌黏液和表達(dá)囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子、各種離子通道等功能，無(wú)論是形態(tài)學(xué)還是功能上都與人體呼吸道上皮細(xì)胞類似。因此，Calu-3 細(xì)胞成為篩選肺吸入制劑的強(qiáng)大工具。肺癌細(xì)胞，如A549 細(xì)胞，既可作為抗腫瘤藥物的靶細(xì)胞用于肺吸入制劑的藥效學(xué)研究，又因其無(wú)限增殖、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)而被廣泛用于細(xì)胞藥物PK 研究。細(xì)胞模型的廣泛應(yīng)用，對(duì)肺吸入藥物的作用機(jī)制、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、大分子藥物的吸入有效性及細(xì)胞毒性等研究提供了較大便利[34-35]。

4 結(jié)語(yǔ)

非臨床PK 研究在藥物研發(fā)早期的有效性和安全性評(píng)價(jià)中有著舉足輕重的作用，對(duì)于肺吸入制劑這種特殊的給藥劑型，盡早開(kāi)展PK 研究尤為重要。在歐盟，大多數(shù)的肺吸入制劑均以PK研究為基礎(chǔ)而獲批[36]。在涉及到前藥或改變給藥途徑的前藥時(shí)，需特別關(guān)注前藥是否可以在呼吸系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成原藥；在進(jìn)行組織分布研究時(shí)，除常規(guī)的主要臟器外，還需重點(diǎn)關(guān)注呼吸系統(tǒng)組織器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含會(huì)厭）、主氣管、支氣管、肺臟及肺灌洗液中的藥物分布；在進(jìn)行代謝研究時(shí)，需關(guān)注藥物是否被肺部藥物代謝酶所代謝，從而影響其生物利用度，并為代謝產(chǎn)物及其途徑的鑒定設(shè)計(jì)提供參數(shù)。