吳瓊，馬群，胡北，崔亞玲，何靜，王卓，許子華（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，沈陽 110016）

牛蒡根，又稱惡實根，為菊科牛蒡屬植物牛蒡Arctium lappaL.的肉質直根，牛蒡主要分布于廣西、山東、安徽、遼寧、湖北、浙江等地，有去熱、消腫的功效[1]，常用于感冒、頭痛、咳嗽、咽喉腫痛等疾病。中藥是以多組分多靶點的作用方式對機體代謝網絡綜合作用而產生結果，因此用中藥的指紋圖譜來結合指標成分含量對中藥材進行質量控制，既可量化、綜合性地闡述中藥的特征，又可以彌補單一有效成分定量控制模式的缺陷[2]。中藥成分復雜，分離和測定均有一定的難度，因此能否選擇主要的藥物成分進行準確的分析，直接關系到對于該中藥質量的評價[3]。并且考慮到實際應用的情況，成分是否可測又是指標成分選擇的前提[4]。近年來，隨著多種多樣的儀器分析技術的出現，以及其在天然產物結構鑒定中的應用，牛蒡根中發(fā)現了越來越多的綠原酸類化合物[5]，目前主要發(fā)現的已分離出來的化合物有1，5-二咖啡酰-3-蘋果?？崴?、3，5-二咖啡酰-1-（2-咖啡酰-4-蘋果酰甲酯）-奎尼酸、3，5-二咖啡酰-1-（2-咖啡酰-4-蘋果酰）-奎尼酸等[6]。有藥理學研究表明，該類化合物具有明顯的神經保護、抗癌、抗菌、抗氧化、降血脂及免疫調節(jié)等作用[7-14]。筆者通過文獻檢索發(fā)現，目前對牛蒡根藥材質量控制標準研究尚不完整，對其化學成分的測定方法和指紋圖譜研究尚淺。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、宏觀的、可量化的手段，可反映中藥化學成分的整體組成和特征。為進一步完善牛蒡根藥材質量評價體系，本研究參考相關文獻[15-16]，采用高效液相色譜（HPLC）法建立了14 批牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜，得到能夠標示其特性的共有色譜峰圖譜，為牛蒡根藥材的應用及其內在質量的均一性提供全面的質量控制依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-16 系列高效液相色譜儀（SPD-16型紫外檢測器、LC-16 型泵、SIL-16 型進樣器、CTO-16 型柱溫箱）（日本島津儀器有限公司）；Shimadzu AUW 120 D 十萬分之一分析天平（日本Shimadzu 公司）；2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會）；KQ3200 型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，150 W，40 kHz）；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（安捷倫）。

1.2 試藥

3，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌罚℉PLC 純度，四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20020403，純度≥98%）；甲醇、乙腈（色譜純，Sigma 公司）；磷酸（分析級，天津永大化學試劑有限公司）；95%乙醇（美華公司，沈陽市遼河化工廠）；雙蒸水為自制。

14 批牛蒡根藥材，產地分別為遼寧、山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北。將各產地編號為S1 ～S14，其中，S1（批號：191115）、S2（批號：191001）產地為安徽；S3（批號：191026）、S4（批號：20191103）產地為廣西；S5（批號：191225）產地為河北；S6（批號：191101）、S7（批號：191201）產地為湖北；S8（批號：191210）產地為吉林；S9（批號：191210）產地為江西；S10（批號：20200326）產地為遼寧；S11（批號：200301）、S12（批號：200115）、S13（批號：200322）產地為山東；S14（批號：200325）產地為浙江。藥材購于遼寧九州通醫(yī)藥有限公司、亳州三峰中藥飲片有限公司。經北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥檢室何靜副主任藥師鑒定為菊科植物牛蒡Arctium lappaL.的干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 HPLC 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.4%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～25 min，10%→15%B；25 ～35 min，15%→20%B，35 ～60 min，20%→30%B）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長330 nm；柱溫35℃；檢測時間為60 min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取適量3，5-二咖啡?？鼘幩釋φ掌罚芊Q定，置于棕色量瓶中，加入少量甲醇，振搖使溶解，后加甲醇定容至刻度，制成每1 mL 含有3，5-二咖啡酰奎寧酸45 μg 的溶液，即得對照品溶液。

2.2.2 牛蒡根提取物的制備 稱取各產地的牛蒡根藥材適量置于圓底燒瓶中，加入10 倍量55%乙醇溶液浸泡過夜，次日回流提取，每次2 h，共2 次，合并提取液并過濾，分產地合并提取液。將各產地的提取液分別加熱濃縮至含藥材1 g·mL－1，4 ℃冰箱保存。

2.2.3 供試品溶液的制備 取濃縮后的提取液4 mL，置10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇定容，靜置24 h，取上清液，經0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 指紋圖譜

2.3.1 精密度試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，將圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），計算相似度，相似度均為1.000。以6 號峰的保留時間（tR）和峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A，結果顯示指紋圖譜中11 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD值分別小于0.24%、3.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣，按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖。將其導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），得到各個樣品的相似度，結果顯示相似度均大于0.999。以6 號峰的相對保留時間（tR）和相對峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD值分別小于0.32%、5.5%，表明牛蒡根提取物供試品溶液在常溫下24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取牛蒡根提取物（S6）樣品溶液，按照“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。將圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版），得到各個樣品的相似度，結果顯示均大于0.999，以6 號峰的相對保留時間（tR）和相對峰面積（A）為參照，計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD分別小于0.090%、5.0%，表明該種分析方法的重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立 取14 批不同產地的藥材，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，根據“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄HPLC 色譜圖，樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）軟件進行分析，以中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，經多點校正、自動匹配后生成牛蒡根提取物指紋圖譜的共有模式如圖1，對照指紋圖譜見圖2。

圖1 14 批次牛蒡根提取物的指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 14 batches of Arctium lappa L.root

圖2 牛蒡根提取物HPLC 對照指紋圖譜Fig 2 Common HPLC model fingerprint of Arctium lappa L.root

2.3.5 共有峰的標定 通過對14 批牛蒡根提取物中的共有峰進行比對分析，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》（2012 版）的數據匹配功能，在對照指紋圖譜上標定共有峰，牛蒡根提取物HPLC 指紋圖譜共有11 個共有峰。同時與對照品色譜圖（見圖3）比對，可確認6 號峰為3，5-二咖啡酰奎寧酸。選擇出峰時間適中、峰面積較大、對稱性較好的6 號峰作為參照峰（S），分別計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果見表1和表2。

表1 牛蒡根提取物共有峰的相對保留時間Tab 1 Relative retention time of common peaks of Arctium lappa L.root

表2 牛蒡根提取物共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks of Arctium lappa L.root

圖3 對照品3，5-二咖啡?？鼘幩岬纳V圖Fig 3 HPLC chromatogram of 3，5-dicaffeoylquinic acid

2.3.6 相似度評價 將各個批次的牛蒡根提取物指紋圖譜分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）軟件，對各批次樣品的指紋圖譜與對照圖譜進行相似度評價。從圖1可以看出14 批牛蒡根藥材的整體圖貌基本一致。14 個產地的牛蒡根藥材的相似度達到了0.966，有較好的相似性，見表3。

表3 牛蒡根提取物相似度Tab 3 Similarity of Arctium lappa L.root

2.3.7 系統聚類分析 分別將14 批牛蒡根提取物樣品的HPLC 指紋圖譜中各自的共有峰的峰面積數據導入SPSS 17.0 統計分析軟件，采用組間聯接法，以歐式平方距離作為分類的依據，對樣品進行聚類分析，結果見圖4。當歐氏距離大于10時，14 批牛蒡根藥材主要被聚為兩類，Ⅰ類包括S1 ～S9、S11 ～S14，各個批次的樣品相似度較高（0.981 ～0.999），產地包括山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北，Ⅱ類為S10（遼寧產地，相似度0.966）。表明這14 批樣品不完全相同，存在一定差異，但差異不大（整體在0.966 以上）。

圖4 14 批藥材指紋圖譜聚類分析的樹狀圖Fig 4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14 batches of samples

3 討論

本研究對牛蒡根檢測的色譜條件進行了選擇及優(yōu)化，分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸水、乙腈/磷酸水不同比例洗脫溶劑對HPLC 色譜圖的影響，結果顯示乙腈-0.4%磷酸水為較優(yōu)溶劑；并進行了全波長掃描，結果顯示330 nm 下色譜峰的數量較多，峰面積較大且分離度較好，故選擇330 nm 作為檢測波長。

對提取方法進行考察，比較了提取溶劑（水、甲醇、乙醇）和不同濃度乙醇（55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇）溶液的提取效果。發(fā)現以55%的乙醇溶液為溶劑加熱回流提取120 min，提取效果最優(yōu)。同時比較了多種流動相的比例對于牛蒡根提取物的分離效果，結果表明使用乙腈（B）-0.4%磷酸水（A）梯度洗脫：0 ～25 min，10%～15%B；25 ～35 min，15% ～20%B；35 ～60 min，20%～30%B，并使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱可以使樣品中各組分得到良好的分離，且保留時間適中。該方法簡潔方便，易于操作，還可減少對色譜儀的損耗，可準確測定牛蒡根藥材中的指標成分。

指紋圖譜中11 個共有峰相對保留時間的RSD值均小于 1.2%，表明本文建立的指紋圖譜研究方法為一種穩(wěn)定的共有模式，可以作為牛蒡根藥材品質評價的方法。14 批樣品相對峰面積RSD值較大，說明各批樣品間組分含量差異較大，提示牛蒡根的品質與其產地密切相關，需對牛蒡根化學成分進行含量測定，闡明藥材品質與產地之間的關系，進一步為臨床使用牛蒡根提供依據。

從相似度分析結果可知，除 S10（遼寧）外，其他相似度均在 0.98 以上，說明不同產地的牛蒡根藥材存在一定差異，但差異不大。同時從聚類分析結果可知，14 批牛蒡根藥材聚為兩類，區(qū)域特征不明顯，與相似度分析結果相一致，說明牛蒡根藥材質量穩(wěn)定。

HPLC 在檢測中藥等物質中有很高的的應用價值，可以清晰指認分離藥物中的各類活性物質[17]。本文通過建立牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜，9 個產地的牛蒡根藥材的圖譜整體外形相近，且相似度也達到了0.966 以上，有較好的相似性。所建立的指紋圖譜，共有峰數目達到11 個，且分離度較好、保留時間合適，相鄰色譜峰之間的分離度較高，色譜峰強度也較大，且根據方法學的驗證結果均滿足要求。綜上可采用HPLC 法對牛蒡根藥材進行質量把控，并對牛蒡根藥材進行綜合宏觀分析，可促進牛蒡根藥材及其相關制劑的研發(fā)并對其質量的控制得到全面提高。