周奕婷,徐鑫悅,宋吉亮,李玉天,葛彬彬,王森森,房春燕,王學?。H坊醫(yī)學院藥學院,山東濰坊 261053)
氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是半靜息態(tài)肝癌干細胞的生物標志物[1],增強APN 表達能促進肝癌干細胞存活。普通肝癌細胞單用化療藥氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)處理,APN上調,隨之產生耐藥性,合用APN 抑制劑烏苯美司(ubenimex)能明顯增強5-FU、順鉑、阿霉素的細胞毒作用,減少肝癌腫瘤干細胞球形成[2-3],提示靶向抑制APN 對于肝癌耐藥可能具有良好的治療效果。另外,APN 在腫瘤轉移方面也發(fā)揮著重要作用[4],因此該蛋白是一個很好的抗腫瘤治療靶點[5]。
目前已有多個實驗室從事小分子氨肽酶N 抑制劑的合成[6-8],因此檢測目標化合物對氨肽酶N 的抑酶活性是必不可少的步驟。而原有的氨肽酶N 抑制劑抑酶活性檢測試劑盒的酶源是從豬腎小體中提取的氨肽酶,已有文獻表明,使用該試劑盒測定化合物抑酶活性不能準確反映對人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。同時該試劑盒價格昂貴(Sigma,L6007),使用成本較高。因此本課題組開發(fā)了一種全新的方法,以人源的氨肽酶N 作為酶源,用于測定化合物的抑酶活性。我們從多種腫瘤細胞勻漿篩選到人白血病K562 細胞勻漿對APN 底物的催化能力最弱,使用該細胞以慢病毒過表達APN,并篩選到單克隆細胞株(K562-APN),以該細胞勻漿作為酶源用于化合物抑酶活性評價[10]。本文主要對該試劑盒的精密度、準確度、穩(wěn)定性等進行檢測,評價該試劑盒能否用于氨肽酶N 抑制劑的抑酶活性測定。
多功能讀板機SpectraMax M5(Molecular Devices),超聲細胞破碎儀(南京寧凱儀器有限公司),DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司),HH-2 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司),離心機(Eppendorf)。L-亮氨酰對硝基苯胺(Sigma,L9125),K562 細胞株(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),烏苯美司(Sigma),Hyclone 1640 液體培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司),Excell 新生牛血清(上海依科賽生物制品有限公司)。
以人白血病K562-APN 細胞勻漿為酶源,L-亮氨酰對硝基苯胺為底物,測定烏苯美司對氨肽酶N 抑制作用的IC50。重復測定3 次,用變異系數(shù)來評價。向96 孔板中分別加入90 μL 氨肽酶N 溶液和不同濃度梯度的烏苯美司溶液(25、50、100、200、400 μmol·L-1),37℃孵育5 min 后,加入10 μL 底物溶液。設置100%組(只加酶和底物),用磷酸鹽緩沖液補足體積至140 μL。37℃孵育1 h,用多功能讀板機測定405 nm 處的吸光度值,通過酶活力變化評價烏苯美司對氨肽酶N 的抑制作用,計算半數(shù)抑制濃度IC50。重復測定3次,取平均值和標準偏差,計算變異系數(shù)。
抑制率=(OD100%組-OD抑制劑組)/OD100%組×100%
在96 孔板中加入10 μL 底物,再分別加入0、20、40、60、80、100 μL 氨肽酶N,測量讀取吸光度。以氨肽酶N 加入量為橫坐標,吸光度為縱坐標,通過線性方程計算出氨肽酶N 加入量為10、30、50、70、90 μL 時的理論值。再另外加入10 μL 底物,分別加入10、30、50、70、90 μL氨肽酶N,孵育后,讀取吸光度,重復測定3 次,取平均值,測得的吸光度為實際值,計算準確度。
取四管氨肽酶N,置于-20℃冰箱,分別反復凍融0、10、20、30 次,凍融后加入底物,37℃孵育后測定吸光度,重復進行3 次,取平均值,用U=[△A/(0.01t)]×D計算酶活力。
U為酶活力;△A為反應時間內吸光度值的變化;t為反應時間(min);D為稀釋倍數(shù),即提取的總酶液為反應系統(tǒng)內酶液的倍數(shù)。
在96 孔板中加入10 μL 底物,再分別加入0、20、40、60、80、100、120 μL 氨肽酶N,用磷酸鹽緩沖液補足體積至120 μL,加入底物37℃孵育后,測定405 nm 處的吸光度,重復測定3次,取平均值。
將10 μL 不同濃度的底物和10 μL 氨肽酶N 加入96 孔板,使底物的工作濃度分別為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol·L-1,37℃恒溫孵育5 min。設置實驗組和對照組,對照組不含氨肽酶N,用磷酸鹽緩沖液補足體積至100 μL,設置多功能讀板機孵育溫度為37 ℃,每分鐘測一次吸光度,共測15 min,即15 組數(shù)據(jù)。根據(jù)Lineweaver-Burk 公式計算:
1/V=Km/Vm·1/[S]+1/Vm
1/V為酶促反應速度的倒數(shù);Km為米氏常數(shù);1/[S]為底物濃度的倒數(shù);Vm為最大反應速度。
重復測定3 次烏苯美司對APN 酶活的抑制率,測得IC50的均值為77.41,標準偏差為3.32。變異系數(shù)CV為4.29%(<15%),說明3 組數(shù)據(jù)間變化小,試劑盒的重現(xiàn)性良好。
以測得的實際吸光度與理論吸光度做差。殘差分別為△A1=0.0102, △A2=0.0037,△A3=0.0122,△A4=0.011,△A5=0.0023。殘差均值△A=0.0079,殘差標準偏差為0.0045,標準化殘差δ*=殘差的均值/殘差的標準差=1.747,δ*遵從標準正態(tài)分布N(0,1)。實驗點的標準化殘差落在(-2,2)區(qū)間以內,可在95%置信度將其判為正常實驗點,參與回歸直線擬合。以上數(shù)據(jù)表明,該試劑盒的準確度好,能保證后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的準確可靠性。
對試劑盒所用酶源的穩(wěn)定性進行評價,取四管氨肽酶N 于-20℃冰箱,分別反復凍融0、10、20、30 次后測定酶活性,重復測定3 次。在反復凍融5 次后酶活力開始有所下降,反復凍融30 次后酶活力下降了28.1%,且在凍融20 ~30次后酶活力趨于穩(wěn)定,說明酶源的穩(wěn)定性良好。結果見圖1。
圖1 氨肽酶N 反復凍融對酶活力的影響Fig 1 Effect of repeated freezing and thawing on the enzyme activity of aminopeptidase N
以“2.4”項下測得的吸光度作圖,線性擬合后所得回歸方程Y=0.0026X+0.0285,R2=0.9827。結果表明氨肽酶N 加入量在0 ~120 μL表現(xiàn)出良好的線性相關,見圖2。
圖2 酶法測定氨肽酶N 的線性范圍Fig 2 Enzymatic determination of the linearity of aminopeptidase N
Km是酶促反應最大速度一半時底物的濃度,Km越小說明酶與底物的親和力越大。為了進一步確認該試劑盒提供的酶源與底物的親和力,本研究采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法測定該酶的Km值。通過檢測405 nm 處不同底物濃度孔每分鐘的吸光度值,計算每個濃度的反應速率,見圖3。以底物濃度的倒數(shù)1/[S]作為橫坐標,反應速率的倒數(shù)1/V為縱坐標作圖,線性擬合所得直線與橫坐標1/[S]交點為-1/Km,見圖4。商品化試劑盒的Km為0.295 mmol·L-1,而該試劑盒的Km值為0.121 mmol·L-1,表明該試劑盒提供的酶與底物的親和力更大。
圖3 不同濃度底物的反應速率Fig 3 Reaction rate of different concentrations of substrate
圖4 氨肽酶N 對L-Leu-P-nitroanilide 的動力學常數(shù)Fig 4 Kinetic constants of aminopeptidase N on L-Leu-P-nitroanilide
由于當前商品化的氨肽酶N 抑酶活性測定試劑盒價格昂貴,且所用酶源是從豬腎小體中提取,因此所測數(shù)據(jù)不能準確反應化合物對人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。
本文對課題組開發(fā)的試劑盒的各項參數(shù)進行了測定,實驗結果表明變異系數(shù)CV=4.29%符合CV<15%的要求,說明該試劑盒具有良好的精確度,能保證后續(xù)開展實驗的合理可靠性[11]。在準確度實驗中,標準化殘差δ*=1.747,δ*遵從標準正態(tài)分布N(0,1),落在(-2,2)區(qū)間以內,在95%置信度內是正常試驗點,說明數(shù)據(jù)準確可靠[12-13]。酶作為一種生物催化劑,能夠以較少的量進行快速有效的反應,同時其反應有最適溫度及pH,因此酶的保藏溫度都是低溫保藏。而在長時間的使用過程中常會進行反復凍融,加之沉降作用,會導致后續(xù)酶促效率的降低,本研究結果表明,氨肽酶N 于-20℃冰箱和室溫反復凍融5 次后酶活力開始下降,凍融20 ~30 次后酶活力趨于穩(wěn)定,酶活力反復凍融30 次后下降28.1%,穩(wěn)定性良好。驗證試劑盒的生物參考區(qū)間的結果表明,當?shù)孜餅?0 μL,氨肽酶N ≤120 μL 時測定的結果是可靠的。Km結果表明該試劑盒提供的酶與底物的親和力更大,能更準確反映化合物對人源氨肽酶N 的抑酶活性。
以上評價數(shù)據(jù)表明本課題組開發(fā)的試劑盒,能準確測定化合物對人源氨肽酶N 的抑酶活性。同時K562 細胞為懸浮培養(yǎng)細胞,適合大規(guī)模培養(yǎng),能夠大量得到酶源,成本低廉。本試劑盒的抑酶活性評價方法,已開始在小范圍應用,數(shù)據(jù)可靠,反饋良好,具備推廣應用及開發(fā)價值。