張曉雙，白黎明，白璐（.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 7046；.西安市第一醫(yī)院藥學部，西安 7000）

阿膠是馬科動物驢及其他驢皮經煎煮濃縮制成的固體膠[1]，其性甘，平，歸肺、肝、腎經，阿膠的藥理作用廣泛，有抗氧化、抗疲勞、提高免疫力、促進造血、抑制癌細胞、止血等作用。兩千多年來，阿膠在中國作為一種保健食品和傳統中藥被廣泛地應用于養(yǎng)生和臨床治療，常治療婦科疾病如陰道出血、痛經、崩漏、不孕、月經先期、復發(fā)性流產、多囊卵巢綜合征、宮頸癌等[2]。本課題組前期研究發(fā)現阿膠16 g·kg－1能提高正常小鼠的子宮系數，提高小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低小鼠血清促黃體生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的含量，使小鼠子宮內膜增厚，子宮腔增大，腺體數目增多，表明阿膠對正常小鼠具有一定的雌激素樣作用[3]。流行病學數據顯示，女性絕經后阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病率是同齡男性的1.5 ～3 倍[4-5]，并且隨著絕經后雌激素的減少，AD 的發(fā)生率增加。臨床上雌激素替代療法能顯著改善絕經期婦女AD 的相關癥狀[6]，但會給患者增加患腫瘤的風險，從天然藥物中尋找有效的AD 防治藥物是目前研究的熱點。本實驗在前期研究基礎上，考察阿膠對去卵巢小鼠學習記憶的影響。

1 材料

1.1 試藥

阿膠（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：19A55）；戊酸雌二醇片（補佳樂，批號：283A，法國拜耳公司）；Mouse ELISA E2kit（96t，森貝伽生物科技有限公司，批號：20191225）；HE 染色試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20190810）；免疫組化試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：40113）；Aβ1-40 抗體（艾博抗貿易有限公司，批號：GR91656-18）。

1.2 動物

雌性未孕小鼠，體質量（20±2）g [成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2015-030]。

1.3 儀器

GB-204 電子天平（瑞士梅特勒）；Forma-86℃ULT Freezer（美國熱電Forma）；KDC-160HR 高速冷凍離心機（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；Morris 水迷宮視頻分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）；德國Leica DM4000B LED 智能型生物顯微鏡（德國Leica）；BI-2000 醫(yī)學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分組及給藥

選取健康雌性未孕小鼠，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液35 mg·kg－1麻醉。將小鼠腹位固定，在軀干下1/3，離開脊柱兩側各1 ～2 cm 處作縱形切口，長約 1 cm，用鑷子拉出脂肪團，找到卵巢，結扎子宮角，剪去卵巢及余線。假手術組只切除卵巢附近的脂肪，不切除卵巢，將組織推回腹腔，縫合切口。腹腔注射青霉素，每日1 次，連續(xù)一周。逐只進行陰道涂片檢查，每日1 次，選取連續(xù)5 d 為間情期小鼠供實驗用。造模成功的小鼠按體質量隨機分成模型對照組、阿膠高劑量組（16 g·kg－1）、阿膠中劑量組（8 g·kg－1）、阿膠低劑量組（4 g·kg－1）和陽性對照組戊酸雌二醇片（0.4 mg·kg－1）組，每組10 只，給藥體積20 mL·kg－1，假手術組給予等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。

2.2 指標檢測

2.2.1 Morris 水迷宮[4]在給藥結束前5 d，開始進行4 d 的Morris 水迷宮的定向航行實驗，記錄從入水至找到安全平臺的時間即逃避潛伏期，測試時間限定為90 s，超過者以90 s 計；空間探索實驗行為測試第5日撤除平臺，在站臺的相鄰象限將小鼠面向池壁放入水中，以原平臺所在的Ⅱ象限作為目標區(qū)，記錄90 s 時限內各組小鼠在原平臺Ⅱ象限游泳時間與總游泳時間的比值和各組小鼠準確穿過原平臺所在位置的次數。

2.2.2 ELISA 法測定血清E2的水平 末次灌胃24 h 后，摘眼球取血，室溫靜置30 min 后3000 r·min－1離心15 min，分離血清，ELISA 法測定血清E2的水平。

2.2.3 HE 染色觀察海馬神經元的形態(tài) Morris水迷宮測試結束后，各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液0.1 mL/10 g 麻醉，快速開胸暴露心臟，將穿刺針通過左心室進入升主動脈，剪開右心耳，快速灌注 37 ℃生理鹽水將血液沖干凈后，緩慢灌注新鮮配制的4 ℃含4%多聚甲醛的 0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液，斷頭剝離顱骨，在潔凈冰盤上完整取出大腦，在4%多聚甲醛的磷酸緩沖液中固定，4 ℃保存，制備石蠟切片。HE 染色，觀察海馬神經元的細胞形態(tài)。

2.2.4 免疫組化法檢測海馬CA1 區(qū)Aβ的表達參照Aβ試劑盒說明書，按常規(guī)SABC 法進行，DAB 顯色，蘇木素復染。以細胞膜或細胞漿著色為棕黃色定為陽性細胞。

2.3 統計方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行統計分析。所有數據采用±s表示，組間比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 阿膠對去卵巢小鼠Morris 水迷宮結果的影響

定向航行實驗中，各組之間第1、2日的潛伏期未見明顯差異。模型組小鼠第3、4日的潛伏期較假手術組明顯延長（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組、阿膠高劑量組小鼠第3、4日的潛伏期明顯縮短（P＜0.05）。空間探索實驗，各組小鼠Ⅱ象限時間（%）差異無統計學意義。模型組站臺穿越次數是0，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組，阿膠高、中劑量組站臺穿越次數明顯增加（P＜0.01）。結果見表1和圖1。

表1 阿膠對去卵巢小鼠Morris 水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗的影響(± s，n ＝10)Tab 1 Effect of Asini Corii Colla on Morris water maze directional navigation experiment and space exploration experiment in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表1 阿膠對去卵巢小鼠Morris 水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗的影響(± s，n ＝10)Tab 1 Effect of Asini Corii Colla on Morris water maze directional navigation experiment and space exploration experiment in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量 逃避潛伏期/s空間探索實驗第1日第2日第3日第4日Ⅱ象限時間/%站臺穿越次數/次假手術組－76.46±22.5867.69±25.32 48.26±23.4835.69±18.5126.94±14.211.50±1.00模型組－77.84±20.1874.25±26.54 72.16±26.48## 67.59±26.35## 22.84±15.440.00±0.00##陽性對照組0.4 mg·kg－1 79.60±25.1864.51±22.28 57.42±28.14* 48.88±26.87*24.95±8.331.10±0.89**阿膠高劑量組16 g·kg－175.15±30.4665.62±33.85 59.45±38.72* 53.31±33.29*20.37±9.091.29±0.59**阿膠中劑量組8 g·kg－175.61±18.1271.18±22.73 66.11±30.0659.52±25.6524.56±9.511.43±0.64**阿膠低劑量組4 g·kg－180.82±19.3375.39±22.65 70.50±23.4464.52±25.2821.10±11.330.4±1.00

圖1 阿膠對去卵巢小鼠Morris 水迷宮空間探索實驗軌跡圖Fig 1 Experimental trace of Asini Corii Colla on Morris water maze in ovariectomized mice

3.2 阿膠對去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響

與假手術組相比，模型組小鼠血清E2水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，阿膠高、中劑量組和陽性對照組小鼠血清E2水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2。

表2 阿膠對去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響(± s，n ＝10)Tab 2 Effect of Asini Corii Colla on the serum E2 hormone level in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表2 阿膠對去卵巢小鼠血清E2 激素水平的影響(± s，n ＝10)Tab 2 Effect of Asini Corii Colla on the serum E2 hormone level in ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（Compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量E2 /（ng·L－1）假手術組－52.20±10.57模型組－20.20±4.87##陽性對照組0.4 mg·kg－178.20±16.54**阿膠高劑量組16 g·kg－133.30±4.00**阿膠中劑量組8 g·kg－129.80±9.82*阿膠低劑量組4 g·kg－125.60±6.70

3.3 阿膠對去卵巢小鼠海馬CA1 區(qū)組織形態(tài)學的影響

假手術組海馬CA1 區(qū)可見緊密排列的錐體細胞，神經細胞核仁、核膜清晰，胞漿染色正常；模型組海馬CA1 區(qū)錐體細胞排列紊亂，部分神經元脫失，神經元大小不一，形態(tài)改變，呈三角形或不規(guī)則形，核固縮，模糊不清，部分細胞皺縮呈細梭形；陽性對照組、阿膠高、中劑量與模型組相比，神經細胞核固縮減少，神經元變性程度減輕，完整錐體細胞數明顯增多。結果見圖2。

圖2 阿膠對去卵巢小鼠海馬組織形態(tài)學的影響（HE，200×）Fig 2 Effect of Asini Corii Colla on histomorphology of hippocampus in ovariectomized mice（HE，200×）

3.4 阿膠對去卵巢小鼠海馬Aβ 的表達的影響

假手術組海馬陽性細胞較少，染色較淡，模型組海馬Aβ陽性細胞較多。與模型組比較，陽性對照組和阿膠高劑量海馬Aβ陽性細胞減少，結果見圖3。

圖3 阿膠對去卵巢小鼠海馬Aβ 表達的影響（免疫組化，200×）Fig 3 Effect of Asini Corii Colla on Aβ expression in hippocampus of ovariectomized mice（immunohistochemistry，200×）

3.5 圖像分析結果顯示

與假手術組比較，模型組海馬Aβ陽性細胞積分光密度（IOD）顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對照組，阿膠高、中劑量組海馬Aβ陽性細胞IOD 顯著減少（P＜0.01，P＜0.05）。結果見表3。

表3 阿膠對去卵巢小鼠海馬Aβ 陽性細胞積分光密度(± s，n ＝10)Tab 3 Effect of Asini Corii Colla on integral optical density of Aβ positive cells in the hippocampus of ovariectomized mice (± s，n ＝10)

表3 阿膠對去卵巢小鼠海馬Aβ 陽性細胞積分光密度(± s，n ＝10)Tab 3 Effect of Asini Corii Colla on integral optical density of Aβ positive cells in the hippocampus of ovariectomized mice (± s，n ＝10)

注（Note）：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01（compared with the sham operation group，##P ＜0.01；compared with the model group，*P ＜0.05，**P ＜0.01）。

組別劑量 IOD假手術組－38.28±8.37模型組－75.50±10.23##陽性對照組0.4 mg·kg－155.18±9.18**阿膠高劑量組 16 g·kg－153.58±11.32**阿膠中劑量組 8 g·kg－162.38±12.65*阿膠低劑量組 4 g·kg－167.28±12.82

4 結論

雌激素是人體內重要的類固醇激素，雌激素主要包括E2，其次為雌酮和雌三醇，E2的生理功效最強，雌激素在體內含量的變化影響生殖系統、中樞神經系統、心血管系統、免疫系統、骨骼系統等的生理代謝過程[7]。卵巢是雌激素的主要來源，婦女進入絕經期后，體內雌激素水平將會快速下降，導致更年期綜合征、骨質疏松癥、AD 和心血管疾病等。更年期婦女采用雌激素替代療法來治療或預防這些絕經期易出現的癥狀。但長期應用雌激素易產生高血壓、水腫等不良反應，并增加乳腺癌及子宮內膜癌等婦科腫瘤的發(fā)病危險。因此人們一直致力于尋求雌激素替代物，期望這種替代物既能發(fā)揮雌激素對心腦血管等系統的保護作用，緩解更年期綜合征，又能避免上述不良反應，這類物質即被稱為選擇性雌激素受體調節(jié)劑[8]。

女性絕經后體內雌激素分泌減少會帶來許多生理、心理上的變化[9]。流行病學數據顯示，圍經期女性存在較高的AD 患病率，而且隨著絕經后雌激素的減少，AD 的發(fā)生率越高。雌激素對于AD 有積極的影響，雌激素能夠促進腦內神經細胞軸突、樹突的生長、突觸的形成，雌激素可促進長時程增強而促進學習記憶，雌激素具有抗興奮性氨基酸毒性、增加大腦皮質血流量和提高大腦葡萄糖的利用率，雌激素可減少神經細胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ片段的產生等[10-11]。去卵巢所致動物模型和雌激素信號通路常用于AD的發(fā)病機制及抗AD 藥物的藥效與機制研究[12]。

阿膠屬于膠類藥材，為動物的皮熬制而成的明膠類物質。從阿膠中檢測和分離出來的成分主要包括氨基酸、蛋白質/明膠、多糖、揮發(fā)性物質、無機物等。阿膠以滋陰補血、補虛止血為見長，適用于血虛萎黃，眩暈心悸、肌痿無力，心煩不眠，虛風內動，肺燥咳嗽，勞嗽咯血，便血崩漏，妊娠胎漏等病癥[13]。本次實驗結果表明，阿膠能夠改善去卵巢AD 小鼠的學習記憶能力，高劑量組作用比較顯著，可能與其神經元保護作用和減少Aβ沉積有關。其作用機制還待進一步研究。