◎ 祝睿文，張 玲，喬立紅，歐陽(yáng)會(huì)，馮美琴，顏玉華

（金陵科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 南京 210038）

蘋(píng)果口感香脆，營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、膳食纖維、黃酮及多酚類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠調(diào)理腸胃、降低血壓和膽固醇[1]，還含有人體所必需的多種糖類(lèi)[2-3]、氨基酸、蛋白質(zhì)以及礦物質(zhì)[4]，具有補(bǔ)氣益血、美容養(yǎng)顏、潤(rùn)肺止咳、健養(yǎng)脾胃的功能[5]。紅棗有軟化血管、抗癌、抑過(guò)敏[6]和預(yù)防高血壓等功效。

復(fù)合發(fā)酵飲料是利用益生菌發(fā)酵后制成的產(chǎn)品[7]，具有廣闊的市場(chǎng)空間和發(fā)展前景。近年來(lái)，已經(jīng)出現(xiàn)蘋(píng)果分別與番茄[8]、蘆薈[9]、胡蘿卜[10]以及紅棗與核桃[11]、竹筍[12]等果蔬制作的復(fù)合發(fā)酵飲料，還未出現(xiàn)以蘋(píng)果與紅棗來(lái)制作復(fù)合發(fā)酵飲料。本研究以蘋(píng)果、紅棗為主原料，選用實(shí)驗(yàn)室自主篩選保藏的乳酸菌F604為發(fā)酵劑，采用單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面研究法，研制乳酸菌發(fā)酵蘋(píng)果紅棗復(fù)合飲料新工藝，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌F604：于金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品系C102冷凍保藏。

蘋(píng)果、紅棗購(gòu)于蘇果超市；蒸餾水；牛肉膏（生物試劑），杭州百思生物技術(shù)有限公司；蛋白胨（生物試劑），上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉（生物試劑），南京茂捷微生物科技有限公司；葡萄糖（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、無(wú)水乙酸鈉（均為分析純），上海久億化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），南京奧佳化工有限公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；孟加拉紅瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，杭州濱河微生物試劑有限公司；果汁培養(yǎng)基（蘋(píng)果汁與紅棗汁體積比為7∶3）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FA2104M電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、BXM-30R高壓滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Shj-Gj-1F超凈臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、HH-3A水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司）、SPX-3008SH-II恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、DJ12B-A11料理機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）及PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與工藝流程

1.3.1 菌種活化及馴化

將乳酸菌菌種以2%（V/V）接種到100 mL MRS培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，后以 2%（V/V）接入100 mL果汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h。

1.3.2 蘋(píng)果汁的制備

選擇飽滿(mǎn)新鮮，無(wú)病蟲(chóng)害的蘋(píng)果削皮，切成 2 cm×2 cm大小的小丁，按料水比1∶3的比例榨汁，過(guò)濾2～3次，制得蘋(píng)果汁。

1.3.3 紅棗汁的制備

選擇色澤光亮，肉質(zhì)肥厚的紅棗，去核，按料水比1∶8的比例，榨汁，過(guò)濾2～3次，制得紅棗汁[13]。

1.3.4 混合果汁的制備及發(fā)酵

將蘋(píng)果汁和紅棗汁按照一定比例混合，于85 ℃水浴鍋中加熱保溫15 min，冷卻，加入不同接種量的乳酸菌，在不同溫度下發(fā)酵不同時(shí)長(zhǎng)。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.4.1 發(fā)酵果汁最適配比的確定

將蘋(píng)果汁和紅棗汁以5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混合，在以乳酸菌接種量為6%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時(shí)間為10 h的確定條件下，進(jìn)行感官評(píng)定及pH的測(cè)定。

1.4.2 發(fā)酵果汁最適接種量的確定

以最佳的混合果汁比，以2%、4%、6%、8%、10%的接種量，在30 ℃條件下發(fā)酵10 h，進(jìn)行感官評(píng)定及pH的測(cè)定。

1.4.3 發(fā)酵果汁最適發(fā)酵溫度的確定

以最佳的混合果汁比，最佳的接種量，在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃條件下發(fā)酵10 h，進(jìn)行感官評(píng)定及pH的測(cè)定。

1.4.4 發(fā)酵果汁最適發(fā)酵時(shí)間的確定

以最佳的混合果汁比，最佳接種量，最佳發(fā)酵溫度為確定條件，發(fā)酵6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，進(jìn)行感官評(píng)定及pH的測(cè)定。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇對(duì)蘋(píng)果紅棗發(fā)酵果汁感官影響較大的果汁混合比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為自變量，感官評(píng)價(jià)得分作為相應(yīng)值，利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)[14-17]，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 感官評(píng)定組織10名食品專(zhuān)業(yè)的學(xué)生，對(duì)發(fā)酵后的果汁進(jìn)行感官評(píng)定。蘋(píng)果紅棗發(fā)酵果汁感官評(píng)定指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 蘋(píng)果紅棗發(fā)酵果汁感官評(píng)定指標(biāo)表

1.6.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

pH值：使用PHS-3C pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，參照《水果和蔬菜產(chǎn)品pH值的測(cè)定方法》（GB/T 10468—1989）。 總酸：采用酸堿滴定法測(cè)定[18]。

1.6.3 微生物指標(biāo)檢測(cè)

乳酸菌檢驗(yàn)：參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》（GB 4789.35—2016）；大腸菌群的測(cè)定：參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）；霉菌的檢驗(yàn)：參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 最佳果汁配比的確定

由圖1可知，蘋(píng)果汁與紅棗汁比例最好為7∶3。若紅棗汁過(guò)多，則發(fā)酵果汁顏色為深紅棕色，聞起來(lái)紅棗味過(guò)重，完全蓋過(guò)蘋(píng)果汁氣味，口感偏甜膩。若蘋(píng)果汁過(guò)多，則發(fā)酵果汁顏色偏淺，聞起來(lái)較清淡，缺少紅棗的醇厚感，口感偏淡。當(dāng)比例為7∶3時(shí)，發(fā)酵果汁顏色為棕黃色，氣味適中，口感較酸甜適宜，感官評(píng)分最高，為80.37。因此，蘋(píng)果汁與紅棗汁比例確定為7∶3。

圖1 蘋(píng)果汁與紅棗汁比例的確定圖

2.1.2 最佳接種量的確定

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵果汁接種量為6%時(shí)，感官評(píng)分最高，所以最佳接種量為6%。發(fā)酵果汁的pH隨接種量的加大而呈下降趨勢(shì)，這是由于一開(kāi)始接種數(shù)較小，接種的菌落基數(shù)較小，繁殖較緩慢，產(chǎn)酸能力較弱；伴隨著接種數(shù)的增加，菌落繁殖越來(lái)越快速，產(chǎn)酸能力也隨之增加[19]。當(dāng)接種量過(guò)少，則發(fā)酵不充分，口感無(wú)發(fā)酵風(fēng)味；當(dāng)接種量過(guò)大，則發(fā)酵過(guò)度，酸味太重，口感不協(xié)調(diào)，不適于飲用；當(dāng)接種量為6%時(shí)，發(fā)酵適中，酸味適度，口感較酸甜適宜，適于飲用。所以接種量確定為6%。

圖2 接種量的確定圖

2.1.3 最佳發(fā)酵溫度的確定

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高，所以確定30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。隨著發(fā)酵溫度的增加，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度低于30 ℃時(shí)，隨溫度的升高乳酸菌生長(zhǎng)速度增加，發(fā)酵特有的酸味越來(lái)越明顯；溫度為30 ℃時(shí)，乳酸菌活性達(dá)到最好，果汁口感酸甜可口，并且具有發(fā)酵特有的風(fēng)味；溫度高于30 ℃時(shí)，乳酸菌過(guò)度發(fā)酵，酸味太重，果汁的風(fēng)味也隨之降低。因此果汁的最佳發(fā)酵溫度 為30 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度的確定圖

2.1.4 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖4可以看出，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為10 h時(shí)，感官評(píng)分最高，所以確定10 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，pH值呈現(xiàn)一直下降的趨勢(shì)，這是由于發(fā)酵前期，果汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和糖類(lèi)充分，菌種利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷產(chǎn)酸，乳酸積累，pH不斷下降；隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，果汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，一些菌種衰老死亡，乳酸積累逐漸減少，另外果汁中前期積累的乳酸可能會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，所以pH趨于不變[20]。即發(fā)酵時(shí)間低于10 h時(shí)，發(fā)酵不充分，乳酸發(fā)酵風(fēng)味未完全釋放；發(fā)酵高于10 h 時(shí)，發(fā)酵過(guò)度，引起發(fā)酵果汁酸敗，口感酸澀，因此果汁的最佳發(fā)酵時(shí)間為10 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間的確定圖

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)定因素水平表，見(jiàn)表2。

表2 因素水平表

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，回歸模型方差分析見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表4 回歸模型方差分析表

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，分析果汁配比、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間各因素對(duì)蘋(píng)果紅棗復(fù)合果汁的感官評(píng)價(jià)的交互作用，其中試驗(yàn)7、9、11、18、28為中心試驗(yàn)，通過(guò)擬合得到了感官評(píng)價(jià)Y的二次多元回歸方程：Y=83.30-0.73A+0.88B-0.98C+0.88D-1.25AC- 3.05AD-2.30BC-1.56BD-1.75CD-4.55A2-5.74B2-5.75C2-3.59D2。通過(guò)分析響應(yīng)面方差，模型P值＜0.000 1，差異極顯著；一次項(xiàng)AD，BC的P值＜0.05，差異顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P值＜0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)差異不顯著，具有實(shí)際意義。由P值可知，影響感官評(píng)價(jià)得分的單因素：發(fā)酵溫度＞接種量=發(fā)酵時(shí)間＞果汁配比。

2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

三維響應(yīng)面是回歸方程的直觀描述，可以形象地體現(xiàn)出各個(gè)因素間的交互作用。從圖5～圖10三維響應(yīng)面圖中可以看出，在所選范圍內(nèi)，均有極值存在，而該極值則是該范圍內(nèi)的最大值點(diǎn)，即感官評(píng)分最大值。

由圖5可知，感官評(píng)分隨著乳酸菌接種量的增加先上升后下降，隨比例的增加變化緩慢，曲面較平緩，二者交互作用不明顯。由圖6可知，感官評(píng)分隨著溫度的增加而先增加后減低，隨比例的變化緩慢增加，三維圖曲面較平緩，二者交互作用不明顯。由圖7和圖8可知，感官評(píng)分隨各因素的交互作用上升，三維圖曲面陡峭，表明各因素之間交互作用顯著。由圖9可知，感官評(píng)分隨著接種量的增加而先上升后下降，隨時(shí)間的增加緩慢增加，曲面較平緩，兩者交互作用不明顯。由圖10可知，感官評(píng)分隨著溫度的增加先上升后下降，隨著時(shí)間增加緩慢，二者交互作用不明顯。

圖5 乳酸菌接種量和果汁配比的交互作用圖

圖6 發(fā)酵溫度與果汁配比的交互作用圖

圖7 發(fā)酵時(shí)間與果汁配比的交互作用圖

圖8 發(fā)酵溫度與乳酸菌接種量的交互作用圖

圖9 發(fā)酵時(shí)間與乳酸菌接種量的交互作用圖

圖10 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互作用圖

由Design Expert V8.0.6軟件，得到優(yōu)化工藝參數(shù)：蘋(píng)果汁∶紅棗汁為7∶3，乳酸菌接種量6.17%，發(fā)酵溫度29.65 ℃，發(fā)酵時(shí)間10.38 h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)回歸模型的預(yù)測(cè)，得到蘋(píng)果紅棗復(fù)合發(fā)酵果汁的最佳工藝參數(shù)為蘋(píng)果汁：紅棗汁為7∶3、乳酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間10.4 h，此時(shí)復(fù)合發(fā)酵果汁的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為83.55。為驗(yàn)證發(fā)酵優(yōu)化工藝的可行性，進(jìn)行3次平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得到的乳酸菌發(fā)酵蘋(píng)果紅棗復(fù)合果汁的感官評(píng)分為82.16，與理論值83.55，相對(duì)誤差1.6%，具有可行性，驗(yàn)證了該模型的正確性。

3 質(zhì)量指標(biāo)

3.1 感官指標(biāo)

按照最佳工藝條件優(yōu)化制得的蘋(píng)果紅棗復(fù)合乳酸菌發(fā)酵飲料呈棕黃色，既有蘋(píng)果的清甜口感，又有紅棗馥郁的香味，兼具乳酸菌發(fā)酵后特殊的乳香，口感酸甜柔和、爽口。飲料穩(wěn)定，無(wú)沉淀渾濁。

3.2 理化指標(biāo)

pH為4.13；酸度為1.88 mol·L-1。

3.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)檢測(cè)：乳酸菌活菌數(shù)為2.6×107CFU·mL-1。 大腸菌群檢測(cè)：大腸菌群＜3.0 CFU·mL-1。霉菌檢測(cè)：霉菌＜1×100 CFU·mL-1。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵蘋(píng)果紅棗復(fù)合飲料的工藝配方，確定了最佳工藝條件：蘋(píng)果汁與紅棗汁體積比為7∶3，乳酸菌接種量6%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間10.4 h，此條件下得到的飲料感官評(píng)價(jià)值最高，組織狀態(tài)穩(wěn)定，酸甜適宜，兼具蘋(píng)果紅棗香氣，具有獨(dú)特乳酸發(fā)酵風(fēng)味。該研究探究了在實(shí)驗(yàn)室條件下蘋(píng)果紅棗復(fù)合發(fā)酵果汁的最佳工藝，以期為復(fù)合發(fā)酵果汁提供一種新型發(fā)酵類(lèi)型和參考依據(jù)。