陸曉晴，祁 微，徐 晴，宋秀雯，何 星，周 佳，田寶霞

（淮陰工學(xué)院，江蘇淮安 223003）

泡菜是以新鮮時(shí)蔬為基本原料，在乳酸菌、醋酸菌及酵母菌等的協(xié)同作用下進(jìn)行厭氧發(fā)酵制成的[1]。從3 000 多年前的商周起，我國泡菜就已經(jīng)初具雛形[2]，且一直以來深受百姓喜愛。自1900 年開始，國內(nèi)外出現(xiàn)了關(guān)于發(fā)酵蔬菜中微生物的系統(tǒng)性研究。Pederson[3]率先對(duì)發(fā)酵泡菜的微生物做出研究，首次提出了蔬菜發(fā)酵啟動(dòng)菌的概念，最后證實(shí)該菌是腸膜明串珠菌。方心芳[4]認(rèn)為，泡菜自然發(fā)酵時(shí)，多種微生物協(xié)同合作完成發(fā)酵，乳酸菌主攻產(chǎn)酸。吳云[5]從市售傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中篩選出15 株乳酸菌，研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌產(chǎn)生低pH 且對(duì)膽鹽具有較強(qiáng)耐受力；添加植物乳桿菌用于發(fā)酵，可縮短泡菜發(fā)酵時(shí)間，降低膽固醇含量。Albury等[6]以酸黃瓜為自然發(fā)酵原料，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸黃瓜發(fā)酵前期以異型發(fā)酵為主，后期以同型發(fā)酵為主。Sanchez等[7]以橄欖為研究對(duì)象，將自然發(fā)酵時(shí)的理化指標(biāo)、菌相消長情況與以戊糖乳桿菌為發(fā)酵劑時(shí)的情況做比較，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵速率低于接種發(fā)酵，但主要酸產(chǎn)物最終達(dá)到平衡。Yildiz 等[8]研究了多種菌相協(xié)同發(fā)酵包菜的情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)多種菌樣交聯(lián)時(shí)會(huì)相互刺激，加快發(fā)酵進(jìn)程。

盡管我國泡菜產(chǎn)量高，技術(shù)水平也越來越成熟，但缺乏足夠的基礎(chǔ)研究，且對(duì)于泡菜發(fā)酵過程中多菌種代謝機(jī)制尚不明確，這阻礙了發(fā)酵生產(chǎn)工藝的發(fā)展進(jìn)程，因此亟需更多關(guān)于蔬菜發(fā)酵中微生物菌群消長代謝規(guī)律的深入研究。本文觀察了從25℃發(fā)酵泡菜中微生物的生長情況，探索了包菜在特定溫度下發(fā)酵，微生物菌系及其動(dòng)態(tài)規(guī)律，以期準(zhǔn)確掌握發(fā)酵過程中泡菜制品的微生物代謝活動(dòng)，為提高泡菜質(zhì)量發(fā)酵提供依據(jù)，同時(shí)也為發(fā)酵蔬菜的工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮包菜、干辣椒、野山椒、去皮生姜、泡菜鹽、老冰糖，均購自本地超市。

考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNS 試劑，北京生東科技有限公司；氫氧化鈉、吐溫-80，上海久億化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；牛血清蛋白，南京奧多福生物科技有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。瓊脂，德國BioFroxx；牛肉浸膏，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；M17 培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司；虎紅瓊脂培養(yǎng)基，江蘇宜興市永信生物有限公司；以上試劑均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3E 型pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；250-D 型光照培養(yǎng)箱，國華電器有限公司；unico UV-2100 紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；艾本德5804R 臺(tái)式高速大容量離心機(jī)，上海珂淮儀器儀器有限公司；JA2603B 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DH-6000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱，金壇市城東科輝儀器廠；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司；HYG-C型多功能搖床，蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基主要有M17 培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、麥凱康瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、GYC 培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方如表1 所示。

表1 培養(yǎng)基的配方Table 1 Formulation of culture medium

1.4 泡菜的制作

將包菜洗凈，晾干后撕成塊狀備用，按照表2 中的配方配制，密封后放入25℃恒溫保溫箱中發(fā)酵，整個(gè)操作過程中要求不能進(jìn)入生水。

表2 不同配方的原料用量Table 2 Raw material consumption of different formulations

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 pH 值和酸度的測定采用pH 計(jì)直接測定泡菜發(fā)酵液的pH，測量3 次后取平均值。酸度的測定采用酸堿滴定法測定。

1.5.2 可溶性蛋白含量的測定

采用牛血清蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取約10 g 發(fā)酵泡菜于研缽中充分研磨后，準(zhǔn)確稱取1 g 于離心管中，加入3 mL 去離子水，3 500 r/min 離心15～20 min，取上清液1 mL 作待測樣品，測定并記錄A595。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出可溶性蛋白含量。

1.5.3 亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽含量采用鹽酸萘乙二胺比色法測定[9]。

取9 支潔凈干燥的50 mL 比色管，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的5 g/mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后每管加對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL、鹽酸奈乙二胺溶液1 mL，用去離子水定容至50 mL，振蕩搖勻，待15 min 后，0 號(hào)管作空白對(duì)照，在538 nm 波長下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取10 g 左右發(fā)酵泡菜于研缽中充分研磨后，準(zhǔn)確稱取5 g 于50 mL 燒杯中，加入10 mL 去離子水、12.5 mL硼砂飽和溶液混合均勻，用150 mL 去離子水將樣品勻漿液洗入250 mL 容量瓶中，80℃水浴20 min。取5 mL 亞鐵氰化鉀溶液于容量瓶中，振蕩，再加入5 mL 乙酸鋅溶液，充分?jǐn)嚢杌靹?，使蛋白質(zhì)沉淀。加去離子水定容至250 mL，搖勻，待30 min 后過濾，將初次過濾得到的濾液廢棄，隨后的濾液作為樣品，測定其中的亞硝酸鹽含量。

1.5.4 還原糖含量的測定

還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定[10]。

1.5.5 微生物計(jì)數(shù)

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行各菌相的計(jì)數(shù)[11]。將每日無菌取樣的包菜發(fā)酵液1 mL 于滅菌干燥試管中，再加入9 mL 無菌生理鹽水混勻后進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)稀釋度涂布三個(gè)平板，計(jì)數(shù)取平均數(shù)。用于檢測乳酸球菌、乳酸桿菌、腸道桿菌的M17、MRS、麥康凱培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48 h；用于檢測酵母菌與醋酸菌的虎紅和GYC 培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)48 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方理化指標(biāo)的測定結(jié)果

檢測了實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)不同配方下的pH 值以及還原糖、可溶性蛋白和亞硝酸鹽含量，具體結(jié)果見表3（見上頁）。

表3 不同配方的理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indexes of different preparations

經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，配方1 中pH 值最低，還原糖、可溶性蛋白含量相對(duì)較高，亞硝酸鹽含量居中。配方2 中亞硝酸鹽含量最高，還原糖含量最低。配方3 中亞硝酸鹽含量最低，但pH 值最高。綜合口感與氣味，按配方1 制作出來的泡菜樣品香味最純正濃郁，爽脆程度也最佳；從健康角度來說，配方1 制作出的泡菜樣品亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于我國亞硝酸鹽安全含量的國家標(biāo)準(zhǔn)GB2714—2003《醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的亞硝酸鹽殘留量不得超過20 mg/kg[12]，健康程度較高。綜合考慮下，將配方1 確定為最佳配方，以配方1 制作的泡菜進(jìn)行后續(xù)的理化指標(biāo)檢測。

2.2 pH 和酸度的變化

pH 值和酸度變化是泡菜自然發(fā)酵過程極為關(guān)鍵的特性參數(shù)，影響微生物數(shù)量及其代謝物活動(dòng)[13-15]。如圖1所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，pH 值逐漸下降，酸度上升，最后都趨于穩(wěn)定。pH 的初始值為6.35，酸度的初始值為0.01%，在0～3 d 時(shí)，pH 值下降速度較快，而3～6 d 時(shí)，pH 值下降開始緩慢并逐漸趨于穩(wěn)定，酸度也趨于穩(wěn)定。發(fā)酵完成時(shí)，pH 為3.8，可滴定酸度為0.6%。

圖1 25℃泡菜自然發(fā)酵過程中pH 值和酸度的變化Fig.1 Changes of pH and acidity of pickles during natural fermentation at 25℃

2.3 可溶性蛋白含量的變化

可溶性蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中被分解成氨基酸等物質(zhì)，影響泡菜的色澤和風(fēng)味[15]。泡菜在25℃恒溫箱中自然發(fā)酵時(shí)可溶性蛋白含量變化如圖2 所示。由圖可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，泡菜的可溶性蛋白含量不斷下降，最后趨于平穩(wěn)。在發(fā)酵第1 天，可溶性蛋白含量急劇下降，由最初的2.232 mg/mL 降至0.345 mg/mL，隨后幾天可溶性蛋白持續(xù)下降，但速度明顯減緩，逐漸到達(dá)一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)，到發(fā)酵第6 天時(shí)只有0.040 mg/mL。

圖2 25℃泡菜自然發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量的變化Fig.2 Changes of soluble protein content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.4 亞硝酸鹽含量的變化

一般來說，較高含量的亞硝酸鹽也會(huì)存在于新鮮的蔬菜中，因?yàn)槲障跛猁}是蔬菜生長中合成所需植物蛋白的必經(jīng)之路。由圖3 可以看出，泡菜從入瓶開始，亞硝酸鹽含量為7.6 mg/kg，經(jīng)過1 d 后到達(dá)最高峰，為12.7 mg/kg；之后亞硝酸鹽含量開始下降，在4～6 d 時(shí)，亞硝酸鹽幾乎呈直線下降，最后降至0.78 mg/kg。可見，泡菜在25℃恒溫箱中自然發(fā)酵時(shí)，亞硝酸鹽含量處于安全狀態(tài)，并未超標(biāo)，在發(fā)酵末期亞硝酸鹽較低，適宜食用。

圖3 25℃泡菜自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes of nitrite content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.5 還原糖含量的變化

泡菜在25℃恒溫箱中發(fā)酵時(shí)還原糖量變化如圖4所示。從圖中可以看出，25℃泡菜自然發(fā)酵中還原糖含量總體呈下降趨勢。0～1 d 時(shí)，還原糖下降速度較快，從初始值4.99 mg/g 降至3.37 mg/g；2～4 d 時(shí)，由3.06 mg/g降至2.58 mg/g，可見下降速度明顯減緩。5～6 d 時(shí)，還原糖含量處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，達(dá)到2.52 mg/g，此時(shí)微生物代謝過程趨近停止。

圖4 25℃泡菜自然發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar content of pickles during natural fermentation at 25℃

2.6 25℃泡菜自然發(fā)酵中微生物菌數(shù)的變化

25℃泡菜自然發(fā)酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌、酵母菌、霉菌、醋酸菌和大腸桿菌的菌數(shù)變化見圖5。

圖5 25℃泡菜自然發(fā)酵過程中微生物菌數(shù)的變化Fig.5 Changes of microbial count of pickles during natural fermentation at 25℃

由圖5 知，發(fā)酵過程中未檢測到霉菌的存在。各微生物的生長曲線顯示，除大腸桿菌，所有被檢測微生物的對(duì)數(shù)生長期均出現(xiàn)在發(fā)酵第1 天，大腸桿菌對(duì)數(shù)生長期持續(xù)到發(fā)酵第2 天，乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌的生長峰值均出現(xiàn)在發(fā)酵第3 天，而酵母菌和大腸桿菌生長峰值出現(xiàn)在發(fā)酵的第2 天，4 d 后所有微生物均處于衰退期；從菌的數(shù)量來看，在峰值階段乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌的菌數(shù)為8～9 lg（CFU/mL），而酵母菌和大腸桿菌的菌數(shù)為4～6 lg（CFU/mL），發(fā)酵4 d 后乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌、大腸桿菌和酵母菌的菌數(shù)分別為8、7～8、6～7、3～4、3 lg（CFU/mL）。由此可見，發(fā)酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌和醋酸菌處于絕對(duì)優(yōu)勢，屬于優(yōu)勢菌，在發(fā)酵過程中發(fā)揮了主要作用。乳酸菌和醋酸菌在影響發(fā)酵速度和泡菜口感方面起到了至關(guān)重要的作用。發(fā)酵過程也發(fā)現(xiàn)了有害菌大腸桿菌，尤其在發(fā)酵的前3 d 內(nèi)，其菌數(shù)最高時(shí)可達(dá)到6 lg（CFU/mL），而當(dāng)發(fā)酵4 d、pH 值降低至4 以下后，大腸桿菌菌數(shù)持續(xù)快速下降，發(fā)酵5 d 后菌數(shù)降低至接近3 lg（CFU/mL），說明從有害微生物的角度看，隨著發(fā)酵pH 值的下降，泡菜的安全性在升高。

3 討論

本研究研究了25℃包菜自然發(fā)酵過程中生理變化情況，初步掌握了酸度、還原糖、亞硝酸鹽、可溶性蛋白以及乳酸桿菌、乳酸球菌、醋酸菌等微生物的變化規(guī)律。發(fā)酵后第1 天可溶性蛋白含量、亞硝酸鹽含量、還原糖含量、發(fā)酵細(xì)菌數(shù)、乳酸球菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)、酵母菌數(shù)，以及醋酸菌數(shù)的變化速率均為最快。這表明本研究條件下，發(fā)酵初期是微生物快速繁殖代謝最為快速、泡菜原材料生化反應(yīng)最為劇烈的階段。由微生物的生長速率可以看出，第1 天可溶性蛋白含量和還原糖含量主要與發(fā)酵中微生物的快速代謝有關(guān)；同時(shí)，泡菜鹽產(chǎn)生的高滲作用使得胞外滲透壓大于胞內(nèi)滲透壓，導(dǎo)致泡菜內(nèi)大量可溶性蛋白外滲流失，蔬菜組織細(xì)胞的衰亡導(dǎo)致大量蛋白酶的分泌，致使可溶性蛋白迅速降解。

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，pH 持續(xù)下降，第4 天開始pH 下降至4 以下，可溶性蛋白含量和還原糖含量降至穩(wěn)定的水平，而被檢測微生物的生長處于衰退期，即微生物的數(shù)量處于下降階段。這表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的代謝消耗發(fā)酵容器中的氧氣，使得發(fā)酵趨向厭氧發(fā)酵，微生物將剩余的糖代謝并分泌有機(jī)酸，造成pH 下降和酸度上升，當(dāng)pH 下降至4 以下后，絕大多數(shù)的微生物代謝活動(dòng)受到抑制并進(jìn)入衰退期，剩余的可溶性蛋白和還原糖維持在一個(gè)較為穩(wěn)定不變的水平。

在發(fā)酵前期，泡菜的pH 較高，腐敗細(xì)菌的生命活動(dòng)不能被有效控制，由細(xì)菌產(chǎn)生的硝酸還原酶會(huì)還原硝酸鹽，生成亞硝酸鹽[16]。泡菜中的酚類物質(zhì)與VC 也將亞硝酸鹽類還原成硝酸鹽，但是生成亞硝酸鹽速率仍大于其被還原率，所以第1 天亞硝酸鹽處于上升期。24 h 后微生物發(fā)酵活動(dòng)增強(qiáng)，乳酸菌變?yōu)榈? 優(yōu)勢菌，主導(dǎo)了發(fā)酵，泡菜瓶內(nèi)pH 降低，逐漸抑制有害菌的生命活動(dòng)。此時(shí)硝酸鹽還原力也不如發(fā)酵前期，亞硝酸鹽生成量降低，發(fā)酵液中的酸或酶類物質(zhì)將會(huì)分解已存在的亞硝酸鹽，使整個(gè)過程中亞硝酸鹽變化曲線呈現(xiàn)“拋物線”形態(tài)。

由發(fā)酵過程中的pH 值、酸度、還原糖、可溶性蛋白以及微生物數(shù)量的變化規(guī)律可見，發(fā)酵4 d 后，即pH 值低于4 以后，進(jìn)入發(fā)酵的相對(duì)穩(wěn)定期，乳酸菌數(shù)量最多，其余依次為醋酸菌、腸道桿菌和酵母菌。在蔬菜發(fā)酵食品中適量的醋酸菌的存在是有利的，醋酸菌帶來的醋酸聯(lián)合乳酸賦予了泡菜獨(dú)特的香氣。發(fā)酵4 d 時(shí)，pH 值低于4 以后，有害菌的數(shù)量快速下降，同時(shí)亞硝酸鹽的濃度也進(jìn)入快速下降期。說明，兼顧食用的安全性和口感，本研究中25℃包菜自然發(fā)酵至少4 d 是比較合適的。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，泡菜在25℃恒溫箱中自然發(fā)酵早期是微生物快速繁殖的主要時(shí)期，發(fā)酵前3 d 各微生物分別達(dá)到各自的數(shù)量峰值，pH 值、還原糖與可溶性蛋白含量都是處于不斷下降狀態(tài)；在發(fā)酵pH 值低于4 以后，還原糖與可溶性蛋白含量逐漸趨于較低的穩(wěn)定水平，亞硝酸鹽含量快速下降，微生物的增長都處于衰退期；整個(gè)發(fā)酵過程中乳酸球菌、乳酸桿菌、醋酸菌、酵母菌、腸道桿菌數(shù)量有差別，未檢測到霉菌，數(shù)量上總體是乳酸菌＞醋酸菌＞細(xì)菌＞腸道桿菌＞酵母菌＞霉菌。乳酸菌又分為球菌和桿菌兩類，球菌數(shù)量上先高于桿菌，而后在發(fā)酵中被桿菌超過，兩者在最高峰時(shí)都達(dá)到了8～9 lg（CFU/mL）。醋酸菌數(shù)量在峰值時(shí)達(dá)到8 lg（CFU/mL），略低于乳酸菌，可見乳酸菌和醋酸菌在25℃泡菜發(fā)酵中是重要的優(yōu)勢微生物，在泡菜的整個(gè)發(fā)酵過程中發(fā)揮了重要作用，也是影響泡菜風(fēng)味和口感的重要調(diào)控點(diǎn)。此外，控制發(fā)酵pH 值達(dá)到4 以下對(duì)于保證泡菜的安全性也是一個(gè)重要的步驟。