朱云琦，董官勇，劉明春*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064；2.四川省鑫源圣果農(nóng)業(yè)有限公司，四川什邡 618400）

果實中，酸味、甜味和香味共同構(gòu)成果實的風(fēng)味品質(zhì)，糖、酸是決定果實內(nèi)在品質(zhì)的重要因素，而香味是人們對果實感官品質(zhì)評價的重要因素。植物的花朵、果實、葉片、根莖等組織通過初生代謝和次生代謝合成數(shù)以千計的具有親脂性的小分子化合物[1]，主要分為醇類、酯類、醚類、醛類和萜類等，以其各自專有的氣味綜合表現(xiàn)為植物的獨特香氣[2]。至今水果的香氣成分已被鑒別出2 000多種，但主要的香氣成分各不相同[3]。Young 等[4]在收獲期測量了蘋果香氣變化，主要香氣成分為乙酸異戊酯（Isoamyl acetate）。涂正順等[5]對‘魁蜜’和‘早鮮’兩種獼猴桃果實香氣成分進行分析，從中檢測出26 種和44 種香氣物質(zhì)，主要香氣物質(zhì)僅有2-己烯醛（2-hexenal）、(E)-2-己烯醛等7 種物質(zhì)對香氣有貢獻。

果實揮發(fā)性香氣中的重要物質(zhì)包括支鏈脂肪族醛、酮、醇和酯類等，而脂肪酸是形成此類物質(zhì)的重要前體物質(zhì)。脂氧合酶通過識別不飽和脂肪酸（如亞油酸和亞麻酸）上的1,4-異戊二烯結(jié)構(gòu)進行氧化催化反應(yīng)，最終形成過氧羥基脂肪酸[6]。大多數(shù)果實都能將過氧羥基脂肪酸轉(zhuǎn)化為醇類物質(zhì)，然后經(jīng)過一系列酶類如乙酰基輔酶A 和乙醇脫氫酶（ADH）、氫過氧化物裂解酶（HPL）的催化作用將醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醛類或酯類物質(zhì)[7]。脂肪族支鏈和芳香族的揮發(fā)性香氣成分通常呈果香型或脂香型，大多數(shù)來源于氨基酸代謝途徑[8]。支鏈酮酸作為重要的代謝途徑中間物質(zhì)可與輔酶A 生成?；o酶A，然后在醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）作用下生成酯類物質(zhì)[9]。萜類化合物可參與植物體內(nèi)重要的生理過程，大量研究表明，萜類物質(zhì)由五碳前體物質(zhì)在萜類合成酶（TPS）的作用下反應(yīng)生成半萜類、單萜類、倍半萜類和雙萜類復(fù)合物，而這些物質(zhì)所需的底物分別為二甲基烯丙基二磷酸、牻牛兒基二磷酸（GPP）、法呢基二磷酸（FPP）、牻牛兒酰牻牛兒基二磷酸（GGPP）。

我國作為獼猴桃屬植物的原產(chǎn)地，為實現(xiàn)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的多元化，野生獼猴桃種質(zhì)資源的研究和選育一直是研究者的主要方向，而在優(yōu)質(zhì)獼猴桃育種材料的研究中，揮發(fā)性香氣物質(zhì)是衡量獼猴桃果實口感和風(fēng)味品質(zhì)的重要物質(zhì)之一。本文以三種優(yōu)質(zhì)美味獼猴桃栽培品種‘秦美’‘華美’‘徐香’為對照，對三種美味野生獼猴桃材料‘kvf54’‘kvf6’以及‘鑫美’采用GC-MS 分析做香氣物質(zhì)間的對比，探究了不同材料間香氣成分的差異，為獼猴桃的選育提供重要的基礎(chǔ)材料，同時為美味獼猴桃的果實質(zhì)量與品種評價、分子輔助育種方法提供依據(jù)，對優(yōu)質(zhì)獼猴桃的品種選育和獼猴桃商品化生產(chǎn)、推動獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有積極作用。

1 材料與方法

1.1 樣品及處理

實驗所需品種與材料均由四川省什邡市凱維孚公司提供，采摘于四川省什邡市下院村凱維孚獼猴桃基地。

本實驗所用美味獼猴桃包括以下三個對照品種：‘秦美’‘華美’和‘徐香’；三個篩選材料：‘kvf54’‘kvf6’和‘鑫美’。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

植物RNA 提取試劑盒，成都百菲特科技有限公司；HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Vazyme 公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 試劑盒，BIO-RAD 公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備

手動SPME 進樣器與手動萃取頭，SUPELCO 公司；氣質(zhì)聯(lián)用儀（GCMS-QP2010），Shimadzu 公司。

1.3 方法

將每個品種的果實采摘后經(jīng)冷庫（1℃）處理一個月后，去皮、切碎、混合，進行SPME-GC-MS 分析，重復(fù)3次。另將剩余果實液氮速凍后用于提取RNA 以及反轉(zhuǎn)錄實驗。

1.3.1 SPME 條件

準確稱取混合物5 g 放于20 mL 的頂空瓶內(nèi)密封。使用SPME 進樣器與手動萃取頭刺入頂空瓶后置于50℃恒溫水浴鍋中萃取40 min，結(jié)束后取出。

1.3.2 GC 條件

將萃取結(jié)束后的微萃取頭置于GC-MS進樣口，250℃解析3 min 后通過GC-MS 進行香氣成分的分析[10-12]。色譜柱為Rxi-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱；載氣源為氦氣，載氣流量為1 mL/min；進樣口溫度為230℃；不分流進樣；升溫程序為以6℃/min 的速率由40℃升至280℃；解析時間為5 min。

1.3.3 MS 條件

EI 離子源；電力電壓為70 eV；離子源溫度200℃；接口溫度220℃；四級桿質(zhì)譜溫度為150℃；倍增器電壓1 200 eV，發(fā)射電流為34.6 A；質(zhì)量掃描范圍（m/z）為20～500。

1.3.4 結(jié)果分析

實驗結(jié)束后，結(jié)果分析采用計算機檢索以及對照標(biāo)準圖譜庫（NIST 05）后導(dǎo)出PDF 格式的文檔，然后根據(jù)保留時間并結(jié)合相關(guān)的參考文獻，以此確定主要的香氣成分，通過歸一化積分法計算各個香氣成分的相對含量，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準差”表示。

1.4 果實香氣成分相關(guān)基因表達

參考文獻設(shè)計引物（Actin[13]、AdLox1-6[14]、AcTPS1[14]、AcATs16[14]）以Actin作為內(nèi)參基因，對獼猴桃果實香氣成分相關(guān)基因進行定量PCR 檢測。實驗結(jié)束后，計算各基因相對表達量，計算公式見式（1）（2）。

式中，ΔCTn-每個基因的CT 值減去Actin的CT 值；ΔCT1-作為選擇其中任意一個ΔCT作為參照；Exp-相對表達量。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)GC-MS 結(jié)果分析（見下頁表1），從6 個美味獼猴桃品種和材料中鑒定主要揮發(fā)性物質(zhì)50 種，其中酯類18 種、醇醛類16 種、萜類7 種，‘秦美’‘華美’‘徐香’‘kvf54’‘kvf6’‘鑫美’中檢測到21、26、18、26、23、26 種主要香氣物質(zhì)。

表1 不同獼猴桃果實香氣成分GC-MS 分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of aroma components of different materials of kiwifruit

2.1 酯類物質(zhì)

‘秦美’‘華美’‘徐香’分別含有8、10、8 種主要酯類化合物，丁酸乙酯是這三種獼猴桃共有的化合物，相對含量分別為10.1%、36.89%、0.92%?！甼vf54’‘kvf6’‘鑫美’分別含有9、10、8 種主要酯類化合物。丁酸丁酯是這6 種美味獼猴桃品種共有的酯類化合物，相對含量分別為‘秦美’0.1%、‘華美’0.24%、‘徐香’0.27%、‘kvf54’0.12%、‘kvf6’0.15%、‘鑫美’1.37%。

2.2 醇醛類物質(zhì)

‘秦美’‘徐香’中主要醇類物質(zhì)有4 種，相對含量較高，分別為34.81%和20.96%；‘華美’‘kvf54’中主要醇類物質(zhì)有6 種，相對含量分別為14.13%和2.05%；‘kvf6’主要醇類物質(zhì)有5 種，相對含量為1.8%；‘鑫美’主要醇類物質(zhì)有8 種，相對含量為5.3%。反式-2-順式-6-壬二烯-1-醇是‘秦美’‘華美’‘徐香’共有的醛類物質(zhì)，相對含量分別為0.25%、0.15%、0.14%。

續(xù)表1

‘秦美’‘華美’‘kvf54’‘kvf6’中主要醛類物質(zhì)有3種，相對含量分別為0.78%、1.94%、1.39%、0.64%，且‘秦美’和‘華美’主要醛類物質(zhì)相同，為正戊醛、異戊醛和壬醛；‘徐香’和‘鑫美’中主要醛類物質(zhì)有2 種，相對含量分別為0.89%、1.42%。

2.3 萜類物質(zhì)

‘秦美’‘徐香’‘kvf6’‘鑫美’中主要萜類物質(zhì)有3種，相對含量分別為1%、5.95%、1.04%、5.3%，2-丁烯是這四種美味獼猴桃共有的萜類化合物，相對含量分別為0.1%、1.15%、0.15%、4.74%；‘華美’‘kvf54’中主要萜類物質(zhì)有4 種，相對含量分別為4.05%、0.8%，1,3-環(huán)戊二酮、芳樟醇是這兩種美味獼猴桃材料共有的萜類化合物；芳樟醇是6 種美味獼猴桃材料共有的萜類化合物，相對含量分別是0.8%、0.45%、4.63%、0.08%、0.8%、0.43%。

2.4 美味獼猴桃后熟過程香氣合成相關(guān)基因表達量

如圖1（見下頁）所示，以‘徐香’為對照，AdLox1、AdLox4、AdLox5在‘kvf54’中表達量顯著性上調(diào)2.18 倍、4.77 倍、4.01 倍，但AdLox6、AcTPS1在‘kvf54’中表達量低于‘徐香’；‘華美’中AdLox1、AdLox2、AdLox6、AcTPS1與AcAT16的表達量均低于‘徐香’，且AdLox6的表達量顯著低于‘徐香’，AdLox3在‘華美’中的表達量是唯一高于‘徐香’的，且差異顯著，表達量相差2.75 倍；‘鑫美’中AdLox5、AcAT16基因表達量顯著高于‘徐香’，分別高5.89 倍和5.34 倍，其余基因的表達量除AdLox2在‘鑫美’中低于在‘徐香’中且無顯著性差異外，均與在‘徐香’中表達量持平；AdLox1、AdLox2、AdLox3、AdLox5、AdLox6在‘kvf6’中表達量顯著上升4.4 倍、3.37 倍、3.35 倍、7.27倍、1.61 倍，同時，‘kvf6’中AcTPS1與AcAT16基因表達量也比在‘徐香’中高2.5 倍、7.8 倍，AdLox4在‘kvf6’中與‘徐香’相比并無顯著性差異；‘秦美’中AdLox3、AdLox6與AcTPS1的表達量相比‘徐香’顯著提高3.83 倍、1.51 倍、2.39 倍，AdLox1、AdLox4、AdLox5、AcAT16在‘鑫美’中的表達量低于‘徐香’，但無顯著性差異，其余基因的表達量均與在‘徐香’中的無明顯差異。

圖1 美味獼猴桃果實后熟過程中果實香氣合成相關(guān)基因表達量Fig.1 The expression of genes related to fruit aroma synthesis during the ripening of kiwifruit

3 討論與結(jié)論

香氣物質(zhì)含量是影響獼猴桃后熟過程中品質(zhì)與口感的重要因素[15]，國內(nèi)外研究獼猴桃香氣成分的報道較多[16]。因為獼猴桃品種或時期的不同，揮發(fā)性物質(zhì)包括酯類、醇醛類和萜類化合物各自的風(fēng)味物質(zhì)含量也大不相同[17]。研究測定了6 種獼猴桃后熟過程中的揮發(fā)性成分，不同材料之間揮發(fā)性物質(zhì)各不相同。AdLox1-6、AdADH1、AdADH2、AcTPS1與AcAT16的表達量也在不同品種間存在差異，與酯類、醇醛類和萜類化合物含量存在一定的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，在美味獼猴桃中亞油酸、亞麻酸在LOX催化作用下產(chǎn)生C6、C9 醛后，在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下形成醇類物質(zhì)后，可經(jīng)酰基轉(zhuǎn)移酶（AAT）的催化最終形成酯類物質(zhì)[18]。系統(tǒng)發(fā)育分析生成已知植物L(fēng)OX 家族的成員可以分為兩個主要的集群組，第一組9-LOX（促進植物器官發(fā)育和果實成熟），包含AdLox2和AdLox5，第二組13-LOX（參與合成六碳醇類、醛類）[14]。本實驗結(jié)果表明，‘kvf54’與‘徐香’相比，AdLox4表達量具有顯著的增加，且增加幅度大，GC-MS 分析結(jié)果也顯示‘kvf54’具有比‘徐香’更多含量的醛類物質(zhì)；‘kvf6’和‘鑫美’中AdLox5的表達相比于‘徐香’而言顯著上調(diào)，GC-MS 分析結(jié)果顯示‘鑫美’具有比‘徐香’更多含量的醛類物質(zhì)，但是‘kvf6’醛類相對含量較少，原因可能是還有其他Lox基因在‘徐香’中上調(diào)表達導(dǎo)致；‘秦美’‘華美’中AdLox3相比于‘徐香’的表達量上調(diào)更加明顯，醛類物質(zhì)相對含量也多于‘徐香’。

獼猴桃果實軟化過程中,酯類含量增加[5]，前人報道發(fā)現(xiàn)AcAT16參與果實中酯類的合成[19]?！蚊馈汀甼vf6’中酯類相對含量較高，酯類合成相關(guān)基因AcAT16在‘鑫美’以及‘kvf6’中表達具有顯著性差異，說明在兩種材料果實采摘后會大量合成酯類物質(zhì)；‘秦美’‘kvf54’‘華美’和‘徐香’中酯類相對含量較少，AcAT16的表達量與對照相比也無顯著性差異。萜類物質(zhì)對植物的生長發(fā)育有很重要的作用，大量研究表明萜類物質(zhì)是由TPS 催化五碳前體物質(zhì)生成，其中關(guān)鍵酶類包括3-羥基-3-甲基戊二?；o酶A 還原酶（HMGR）和脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶（DXR）[20]。GC-MS 結(jié)果表明，三種美味獼猴桃果實均檢測到特征性萜類香氣物質(zhì)桉油精，研究報道桉油精在擬南芥中的生物合成推測是由AcTPS1基因調(diào)控的[21]。‘秦美’與‘鑫美’中檢測到桉油精成分，AcTPS1表達量相對‘徐香’上調(diào)幅度較小?！A美’中檢測到桉油精成分，但AcTPS1與‘徐香’并無顯著性差異，‘kvf6’中AcTPS1表達較高，但并未檢測到桉油精成分，原因可能是萜類化合物含量還可以受HMGR、DXR 這兩種酶的調(diào)控基因表達影響。