趙新禮 舒泉湧 崔蕾 朱愛(ài)華

摘要 [目的]應(yīng)用DNA條形碼鑒定技術(shù)對(duì)短柄五加等五加屬植物進(jìn)行研究，以弄清倒卵葉五加和短柄五加的物種關(guān)系。[方法]通過(guò)對(duì)館藏標(biāo)本與現(xiàn)地植物形態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，采用通用引物 ITS2 和 psbA-trnH對(duì)采自陜甘寧地區(qū)的短柄五加等50個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增后雙向測(cè)序，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載了五加屬等相關(guān)植物的序列，分別通過(guò)ITS2 database或其序列注釋，獲得ITS2和psbA-trnH序列，隨后進(jìn)行BLAST比對(duì)鑒定分析;用MEGA 6.06軟件對(duì)所得序列進(jìn)行比對(duì)，分析變異位點(diǎn)，計(jì)算GC含量、種內(nèi)和種間遺傳距離，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]ITS2 和 psbA-trnH 序列的 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序成功率均為100%;倒卵葉五加和短柄五加的植物形態(tài)、ITS2序列和psbA-trnH序列完全相同。ITS2 序列：短柄五加和糙葉五加僅有一個(gè)堿基的差異，蜀五加與藤五加序列相同;psbA-trnH 序列：短柄五加與糙葉五加的差異顯著，短柄五加與蜀五加序列相同。[結(jié)論]同時(shí)使用ITS2、psbA-trnH這2個(gè)標(biāo)記的DNA 條形碼可以準(zhǔn)確鑒別短柄五加等五加屬植物;短柄五加與倒卵葉五加為同一種植物。

關(guān)鍵詞 倒卵葉五加;短柄五加;基原鑒定;DNA條形碼;ITS2;psbA-trnH

中圖分類號(hào) R 282.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2021）15-0166-07

Abstract [Objective]The molecular identification technique of DNA barcode was used to identify the species of several plants of ?Eleutherococcus ?Maxim. in order to understand the relationship between ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus obovatus . [Method]By observing the morphology of collection specimens and onsite plants， using universal primers ITS2 and psbAtrnH， 50 samples including ?Eleutherococcus brachypus ?collected from Shaanxi， Gansu and Ningxia were amplified and sequenced in both directions，and downloaded the sequence of Araliacea and other related plants from GenBank database， obtained ITS2 and psbAtrnH sequence through ITS2 database or its sequence annotation， and then performed BLAST comparison and identification analysis.MEGA 6.06 software was used to compare the obtained sequences， analyze the mutation sites， calculate the GC content， intra and interspecies genetic distance， and construct the NJ phylogenetic tree.[Result]The success rate of PCR amplification and sequencing of ITS2 and psbAtrnH was 100%.The plant morphology， ITS2 sequence and psbAtrnH sequence of ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus obovatus ?were identical. ITS2 sequence： ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus henryi ?had only one base difference， and the sequence of ?Eleutherococcus leucorrhizus ?var. ?setchuenensis ?was the same as that of ?Eleutherococcus leucorrhizus .The sequence of psbAtrnH： ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus henryi ?sequence were significantly different， and the sequence of ?Eleutherococcus brachypus ?and ?Eleutherococcus leucorrhizus ?var. ?setchuenensis ?was the same.[Conclusion]At the same time， using ITS2 and psbAtrnH genetic markers， DNA barcode technology can accurately identify the 4 species of ?Eleutherococcus ?Maxim.; ?E. brachypus ?and ?E. obovatus ?should be the same plant.

Key words ?Eleutherococcus obovatus;Eleutherococcus brachypus ;Base source identification;DNA barcoding;ITS2（internal transcribed spacer 2 sequence）;psbAtrnH（psbAtrnH intergenic spacer sequence）

基金項(xiàng)目 陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2016KTTSSF 01-01-02）;陜西省咸陽(yáng)市重大科技專項(xiàng)（2014K 01-17）。

作者簡(jiǎn)介 趙新禮（1961—），男，陜西扶風(fēng)人，主任藥師，從事中藥資源與栽培及分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2021-01-27

倒卵葉五加與著名的中藥材刺五加具有相似的化學(xué)成分和藥理作用[1-2]，倒卵葉五加與短柄五加兩者分布區(qū)域重疊，植物形態(tài)高度相似，在其產(chǎn)區(qū)內(nèi)均作為倒卵葉五加藥材使用，究竟兩者為同一種植物還是2種植物長(zhǎng)期以來(lái)存在爭(zhēng)議[3-5]。自20世紀(jì)80年代倒卵葉五加被開發(fā)以來(lái)，由于無(wú)節(jié)制的采集使資源量銳減，為保證用藥的安全性和有效性，以及其野生撫育與栽培物種的準(zhǔn)確性，有必要對(duì)該中藥材的基原進(jìn)行鑒定研究。

傳統(tǒng)的中藥材基原鑒定即依據(jù)其植物形態(tài)學(xué)和分類學(xué)原理，根據(jù)形態(tài)鑒別特征，確定到物種的生物學(xué)名，這種鑒定方式受到鑒定人員知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)等因素的影響，具有一定的局限性。DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段或幾段公認(rèn)的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，以自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的分子鑒定技術(shù)，可以對(duì)物種實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的鑒定，不受發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件等的限制，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法在這方面的不足。

陳士林等[6]通過(guò)對(duì)大量中藥材進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心、psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系，并將該方法納入2015年版《中國(guó)藥典》。ITS2序列是去除5.8S和28S rRNA基因序列的核糖體DNA序列間隔區(qū)，psbA-trnH序列是位于葉綠體編碼光合系統(tǒng)D1蛋白的psbA基因和編碼tRNA組氨酸的trnH基因之間的一段非編碼區(qū)，兩者均具有進(jìn)化速率快、引物通用性好、片段足夠短、易擴(kuò)增與測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于人參屬[7]、忍冬屬[8]、枸杞屬[9]、益母草[10]、覆盆子[11]、商陸[12]、活血丹[13]、金叉石斛[14]等藥材基原物種鑒定，五加皮[15]、竹節(jié)參[16]、當(dāng)歸[17]等中藥材真?zhèn)舞b別，人參[18]、西洋參[18]、蒼術(shù)[19]等中藥材種子種苗的鑒定。

該研究采用植物形態(tài)鑒定與DNA條形碼分子鑒定技術(shù)相結(jié)合，利用通用引物ITS2和psbA-trnH序列對(duì)五加屬短柄五加等4種植物的50份標(biāo)本進(jìn)行鑒定分析，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的近緣物種序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，弄清倒卵葉五加和短柄五加間的物種關(guān)系，為倒卵葉五加藥材DNA條形碼鑒定方法的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

1.1.1.1 館藏標(biāo)本。西北農(nóng)林科技大學(xué)和陜西中藥研究所館藏的倒卵葉五加和短柄五加標(biāo)本。

1.1.1.2 現(xiàn)地調(diào)查。對(duì)陜西、甘肅、寧夏的16個(gè)區(qū)縣進(jìn)行五加資源野外調(diào)查、采集標(biāo)本與分析樣品（表1）。標(biāo)本經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)吳振海高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，現(xiàn)存放在陜西中藥研究所標(biāo)本室。

1.1.1.3 樣品采集。每個(gè)區(qū)縣選取2～4個(gè)五加居群，在每個(gè)居群內(nèi)選取相距2 m以上的10個(gè)植株，每株采集嫩葉一片放入自封袋內(nèi)，加入硅膠快速干燥。待葉片徹底干燥后存放于-40 ℃的冰箱中備用。

1.1.1.4 五加屬等物種的ITS2和psbA-trnH序列。五加屬等物種的ITS2和psbA-trnH序列均來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（表2）。

1.1.2 試劑。

DNA Marker、植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化）;Tris、EDTA、冰乙酸、瓊脂糖等（西安海默生物）;DNA凝膠回收試劑盒（北京擎科新業(yè)生物）;Prime STAR HS DNA Polymerase（Takara，美國(guó)）。

1.1.3 儀器。

高速冷凍離心機(jī)（eppendorf 5810R，德國(guó)）;PCR擴(kuò)增儀（Life，美國(guó)）;制冰機(jī)（IMS-50，西安儀創(chuàng)）;電泳儀（JUNYI-300，北京君意）;凝膠成像儀（SAGECREATION，北京賽智）;基因測(cè)序儀器（ABI 3730，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 植物標(biāo)本鑒定。依照植物的形態(tài)特征，參考文獻(xiàn)資料，按傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定[4]。

1.2.2 DNA提取。用干凈的剪刀將試樣剪碎，混勻，稱取適量，用植物基因組DNA提取試劑盒依照說(shuō)明書提取，提取液 -20 ℃ 保存。

1.2.3 引物。參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[20]，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成（表3）。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

1.2.4.1 擴(kuò)增體系。DNA模板1 μL，5X Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，引物1與引物2各1 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase ?0.25 μL，ddH2O 14.75 μL補(bǔ)足至 25 μL。

1.2.4.2 擴(kuò)增程序。94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 35 s，33 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，16 ℃停止。

1.2.4.3

PCR產(chǎn)物電泳及DNA純化回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)15%的瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段割膠，并使用DNA凝膠回收試劑盒按說(shuō)明書進(jìn)行DNA片段的純化回收。

1.2.4.4

DNA序列的測(cè)序。將純化的產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Chromas軟件對(duì)測(cè)序所得到的峰圖進(jìn)行人工校對(duì);用CodonCode Aligner V6.0.2軟件進(jìn)行拼接。ITS2序列基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法采用ITS2 database網(wǎng)站（http：//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）進(jìn)行序列注釋，去除兩端的5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同屬物種psbA-trnH的注釋，去除序列兩端的psbA和trnH基因，獲得完整的psbA-trnH基因間隔區(qū)序列。用MEGA 6.06軟件進(jìn)行序列對(duì)比，分析變異位點(diǎn)，計(jì)算GC含量，用Kimura 2-Parameter（K2P）法將所有數(shù)據(jù)計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，用NJ鄰接法（Neighbour 2 Joining Method，NJ）將比對(duì)過(guò)的序列分別構(gòu)建成五加屬植物的ITS2、pbsA-trnH序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，各個(gè)分支的支持率使用bootstrap重復(fù)1 000次進(jìn)行檢驗(yàn)。最終將獲得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行樣品序列的BLAST（basic local alignment search tool）用最高相似搜索法進(jìn)行確認(rèn)比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物形態(tài)鑒定

對(duì)館藏的倒卵葉五加和短柄五加標(biāo)本進(jìn)行了仔細(xì)觀測(cè)比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)兩者的顯著區(qū)別。

2018年7—8月到陜甘寧地區(qū)的16個(gè)區(qū)縣，對(duì)50個(gè)五加居群進(jìn)行野外調(diào)查，采集標(biāo)本與分析樣品。采集的標(biāo)本經(jīng)鑒定，其中倒卵葉五加和短柄五加共42份，均鑒定為短柄五加;藤五加2份;蜀五加4份;糙葉五加2份。調(diào)查發(fā)現(xiàn)倒卵葉五加藥材的混淆品有藤五加和蜀五加（甘肅）、糙葉五加（陜西隴縣）。

倒卵葉五加藥材主產(chǎn)地的人們對(duì)其原植物短柄五加的叫法不一，如在陜西的旬邑、黃陵、黃龍、寶塔區(qū)、志丹、隴縣，甘肅的華池、合水、正寧、靈臺(tái)等地稱倒卵葉五加或倒刨牛;在宜君、甘泉、涇源、清水、崆峒區(qū)等地稱短柄五加或甘肅刺五加，其植物特征為：直立灌木，莖圓柱形，多分枝，株高0.5～3.0 m。在灌叢的頂部常生出向上的長(zhǎng)枝與側(cè)生出短枝，下部老枝及根莖發(fā)出的枝條全為長(zhǎng)枝;幼枝無(wú)毛，葉柄的基部常生1～2個(gè)刺，細(xì)長(zhǎng)，下彎，基部不膨大。掌狀復(fù)葉，小葉通常5枚;在長(zhǎng)枝上葉互生，在短枝上葉簇生;幼枝的上部總?cè)~柄無(wú)或極短，無(wú)毛，無(wú)刺;從枝頂15～45 cm往下，總?cè)~柄漸長(zhǎng)，達(dá)2～12 cm，具縱棱。從灌叢枝條上端側(cè)生的短枝上，葉近于無(wú)柄，無(wú)毛，無(wú)刺，小葉亦較小，常數(shù)片簇生。小葉片薄紙質(zhì)，倒卵形、倒卵狀長(zhǎng)圓形，稀菱形，葉尖圓形或短尖，基部狹尖，楔形，兩面均無(wú)毛，邊緣近全緣或上部邊緣具數(shù)對(duì)鈍形齒牙;側(cè)脈3～5對(duì)。傘形花序單生或數(shù)個(gè)形成圓錐花序頂生于枝端，徑1～4 cm，有花多數(shù)。總花梗長(zhǎng)1～8 cm，具縱棱，無(wú)毛，無(wú)刺;花梗細(xì)長(zhǎng)，長(zhǎng)0.6～2.0 cm，無(wú)毛。由于受生長(zhǎng)環(huán)境的影響，植株間在形態(tài)上有少許差異，如短枝上或光照不好的情況下傘形花序較小、總花梗較短，長(zhǎng)枝上或光照較好時(shí)傘形花序較大，花梗也較長(zhǎng);花淺黃綠色。苞片卵形，紫色，長(zhǎng)約1 mm，先端叢生銹毛，邊緣疏生纖毛;花萼無(wú)毛或有短柔毛，邊緣具5個(gè)三角形小裂齒?；ò?枚，三角狀卵形，先端尖，無(wú)毛，長(zhǎng)約2 mm，開花時(shí)反曲。雄蕊5個(gè)，花絲長(zhǎng)約2 mm?；ㄖ?個(gè)，全部合生成柱狀。子房5室。果實(shí)橢圓狀球形，未成熟時(shí)綠色、綠黑色、黑色，成熟后黑紫色，直徑5～8 mm，風(fēng)干時(shí)有5棱，宿存花柱長(zhǎng)1.5～2.0 mm?；ㄆ?—8月。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

所有五加樣本ITS2序列與psbA-trnH序列PCR擴(kuò)增均在序列長(zhǎng)度500～750 bp出現(xiàn)一條清晰的DNA條帶（圖 1）。

2.3 序列測(cè)定結(jié)果

2.3.1

ITS2序列。ITS2引物的擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率均為100%。短柄五加等樣本經(jīng)ITS2 ?F/R引物擴(kuò)增后得到一段長(zhǎng)455～498 bp的序列，去掉兩端的5.8S和28S區(qū)段后，獲得的ITS2序列長(zhǎng)度為229～230 bp，GC含量為62.6%～63.0%。經(jīng)兩頭等齊對(duì)比，短柄五加在序列18位有一個(gè)C的缺失;糙葉五加與短柄五加相比在18位多一個(gè)C;藤五加與蜀五加的ITS2序列完全相同，與短柄五加相比在18位多一個(gè)C，在24位發(fā)生T/A的轉(zhuǎn)換，在25位發(fā)生G/T的顛換。

短柄五加ITS2序列：

1 CGCATCGCGT CGCCCCC-AA CCCTGCACTC CCTCATGGGA GTCATGACTG

51 AGGGGCGGAT ACTGGCCTCC CGTGTCTCAC CGCGCGGTTG GCCCAAATGT

101 GAGTCCTTGG CGACGGACGT CACGACAAGT GGTGGTTGTA AAAAGCCCTC

151 TTCTCCTGTC GTGCGGTGGC CCGTCGCCAG CAAAAGCTCA TGTGACCCTG

201 TTGTGCCGTC CTCGACGAGC ACTCCGACCG

2.3.2

psbA-trnH序列。psbA-trnH引物的擴(kuò)增效率與測(cè)序成功率均為100%。短柄五加等樣本經(jīng)psbA-F/trnH-R引物擴(kuò)增得到一段長(zhǎng)487～522 bp的序列，去掉兩端的psbA和trnH基因后，獲得的psbA-trnH序列長(zhǎng)度為392～399 bp，GC含量為28.3%～28.6%。psbA-trnH序列分別在短柄五加、蜀五加和糙葉五加種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)差異為0，在藤五加種內(nèi)有一個(gè)變異位點(diǎn)的差異。短柄五加、蜀五加及甘肅清水產(chǎn)的藤五加三者psbA-trnH序列完全相同，甘肅清水產(chǎn)藤五加以3葉為主，少5葉;陜西隴縣產(chǎn)的藤五加全為3葉，與短柄五加相比在290位有一個(gè)G/C轉(zhuǎn)換。糙葉五加與短柄五加相比分別在149、294、397位有T/G、A/G、G/A的顛換，在132～133、393位發(fā)生AA/TT、C/G的轉(zhuǎn)換，在154～155位發(fā)生AT的缺失，在330～338位有一個(gè)CATAAGAAA序列片段的插入。

短柄五加psbA-trnH 序列：

1 GACCCGGTCT TAGTGTATAC GAGTTTTTTT GAAATAAAAA GGAGCAATAA

51 CCTCTTTCTT GTTCTATCAA GAGGGCGGTA TTGCTCCTTT TTTTATTTAG

101 TAGTATTTGT ACTTACCTAG TTTCTTTAAA TTTATTTAAA GAAACGTCGT

151 TTTATTTTTA TTGGTTGGTT CATGAGTGAG TATCATGCTT TCGTTCTGTA

201 TTAATCATTA ATCTAGAATT TAGCTACTTC TTCCCAATCT TTTGGGAAGT

251 ATTTTTTAAA AAGAAAAGAT AAAAATGTTG GACTTTTTAC TTAGTTAATA

301 CTTAATATTT TTATCTCGAA AATAAGAAAG AAATAATGAT GAATGGTAAA

351 AGTTTAATCT TTTGAAACGT AAGGAAAAGA ATAGTAGAGG GG

2.4 五加屬植物ITS2序列的差異與遺傳距離分析

五加屬植物的ITS2序列長(zhǎng)度為229～231 bp，GC含量61.1%～641%。當(dāng)空位（gap）作為缺失處理時(shí)，序列兩端對(duì)齊比對(duì)，屬內(nèi)保守位點(diǎn)210個(gè)，變異位點(diǎn)21個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)8個(gè)，自裔位點(diǎn)13個(gè)（表4）。短柄五加、糙葉五加、藤五加和蜀五加的ITS2序列在種內(nèi)完全相同，種內(nèi)遺傳距離均為0。屬內(nèi)種間遺傳距離為0.000～0.055，平均為0.020。短柄五加和糙葉五加與紅毛五加間的遺傳距離為0;藤五加與蜀五加間的遺傳距離為0，刺五加與無(wú)梗五加間的遺傳距離為0;烏蘞莓五加與狹葉五加間的遺傳距離為0。可見ITS2序列在同物種之間高度保守，同屬不同種間、種內(nèi)變種之間遺傳距離差異有時(shí)不明顯，因此，ITS2序列只能作為鑒別五加屬物種的依據(jù)之一。

2.5 五加屬植物psbA-trnH序列的差異與遺傳距離分析

五加屬植物的psbA-trnH序列長(zhǎng)度為392～399 bp，GC含量27.4%～28.8%。當(dāng)空位（gap）作為缺失處理時(shí)，序列兩端對(duì)齊比對(duì)（401 bp），屬內(nèi)保守位點(diǎn)387個(gè)，變異位點(diǎn)14個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)11個(gè)，自裔位點(diǎn)3個(gè)（表5）。糙葉五加、二歧五加、無(wú)梗五加和 E.japonicus 在154～155位有一個(gè)AT的缺失，在330～338位分別有一個(gè)CATAAGAAA的插入片段。短柄五加、蜀五加、糙葉五加3個(gè)種種內(nèi)遺傳距離均為0;甘肅產(chǎn)藤五加與陜西產(chǎn)藤五加的種內(nèi)遺傳距離為0.003。屬內(nèi)種間遺傳距離為0.000～0.026，平均為0.013。短柄五加與蜀五加、紅毛五加和甘肅產(chǎn)藤五加間的遺傳距離為0;糙葉五加與 E.japonicus 間的遺傳距離為0;二歧五加與無(wú)梗五加、刺五加之間的遺傳距離為0?？梢?，psbA-trnH序列在同物種之間高度保守，同屬不同種間遺傳距離差異有時(shí)不明顯，因此psbA-trnH序列也只能作為鑒別五加屬物種的依據(jù)之一。

將ITS2和psbA-trnH序列的特征參數(shù)匯總（表6）。K2P遺傳距離計(jì)算顯示，psbA-trnH序列種間遺傳距離為0.013，小于ITS2序列的種間遺傳距離（0.020）;psbA-trnH序列的變異率為3.50%，小于ITS2序列的9.09%，說(shuō)明psbA-trnH較ITS2序列保守，2種候選序列種內(nèi)遺傳距離為0或0～0003，小于種間遺傳距離，存在明顯的barcoding gap。

2.6 序列比對(duì)鑒定

對(duì)測(cè)定所獲得的ITS2、psbA-trnH序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中利用BLAST進(jìn)行最高相似性搜索，進(jìn)行確認(rèn)比對(duì)分析。

2.6.1 倒卵葉五加和短柄五加的鑒定。共42個(gè)樣本，從植物形態(tài)上看完全相同，統(tǒng)一鑒定為短柄五加;所有樣品其測(cè)序結(jié)果ITS2序列、psbA-trnH序列完全相同。其ITS2序列與紅毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性為99.57%，而psbA-trnH序列與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為100%，因此認(rèn)為短柄五加和倒卵葉五加是同一種植物，且與紅毛五加的親緣關(guān)系較近。

2.6.2 藤五加和蜀五加的鑒定。2個(gè)種共6個(gè)樣為一組，其ITS2序列完全相同，與藤五加（MH703148.1）、蜀五加（MH710849.1、MH703119.1）的相似性為100%。

在GenBank中無(wú)藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相關(guān)數(shù)據(jù)。該研究所測(cè)定的蜀五加4個(gè)樣和甘肅產(chǎn)藤五加1個(gè)樣共5個(gè)樣的 psbA-trnH 與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為100%;陜西隴縣產(chǎn)藤五加的 psbA-trnH序列與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性為99.74%。

2.6.3 糙葉五加的鑒定。2個(gè)樣本為一組，其ITS2序列與紅毛五加（KR080440.1、KR080438.1、MH711360.1）和藤五加（MH711366.1）的相似性為100%，與刺五加（KU724205.1）和無(wú)梗五加（MF095901.1）的相似性為99.57%;其psbA-trnH序列與刺五加（MF348735.1）、無(wú)梗五加（KT153019.1）的相似性為99.75%，與紅毛五加（GQ435397.1）的相似性僅為96.01%。

在GenBank中未見糙葉五加 ITS2和psbA-trnH序列的相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.7 序列聚類分析

基于 K2P雙參數(shù)模型構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹能顯示物種間的親緣關(guān)系，幫助判斷物種的進(jìn)化關(guān)系。五加屬可能起源于鵝掌柴屬（ Schefflera ）[3]，故選其作為外類群構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.7.1 ITS2序列的聚類分析。五加屬植物的ITS2序列經(jīng)過(guò)全局比對(duì)構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。五加屬植物聚為一大支，其中所有測(cè)定的短柄五加、糙葉五加和紅毛五加聚為一小支，藤五加和蜀五加聚為另一小分枝。

2.7.2 psbA-trnH序列的聚類分析。psbA-trnH序列構(gòu)建的五加屬植物NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。五加屬植物獨(dú)聚為一支，其中所有測(cè)定的短柄五加、藤五加和蜀五加與紅毛五加等聚為一小枝，糙葉五加與無(wú)梗五加、刺五加等聚為另一小枝。

3 結(jié)論

目前 DNA 條形碼研究主要集中在如何提高近緣類群物種分辨率和構(gòu)建區(qū)域條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)2個(gè)方向。受物種特異性影響，同屬物種較低的種間差異性以及分化產(chǎn)生的新物種的出現(xiàn)，都會(huì)增加物種分類鑒定的難度。

建立良好的DNA條形碼鑒定體系需要幾個(gè)序列進(jìn)行相互補(bǔ)充，或與其他分子標(biāo)記結(jié)合，才能提高DNA條形碼技術(shù)鑒定的效率。

盡管 ITS2 序列對(duì)大多數(shù)植物可以進(jìn)行鑒定，但由于其序列較短，遺傳信息有限，在鑒定近緣種或變種上仍存在一些不能鑒定的情況，增加psbA-trnH序列作為物種鑒別的輔助序列，可以將短柄五加、糙葉五加、藤五加和蜀五加準(zhǔn)確鑒定，為鑒定短柄五加及其同屬植物提供新的分子鑒定方法，為控制藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

通過(guò)對(duì)現(xiàn)地42個(gè)短柄五加和倒卵葉五加居群的觀測(cè)，認(rèn)為總?cè)~柄的長(zhǎng)短、傘形花序的大小、總花梗的長(zhǎng)短是與標(biāo)本采集枝條的著生部位有關(guān)，是植物適應(yīng)環(huán)境條件的結(jié)果，不能作為劃分種的依據(jù)。通過(guò)對(duì)42 份植物樣本的ITS2和 psbA-trnH 序列測(cè)定分析，其種內(nèi)序列差異為0，與五加屬其他物種間序列差異明顯，可以認(rèn)定兩者為同一個(gè)物種，命名為短柄五加，即倒卵葉五加藥材的基原植物為短柄五加。

通過(guò)對(duì)糙葉五加、藤五加和蜀五加共8份植物樣品的ITS2和psbA-trnH序列分析，其結(jié)果與植物形態(tài)分類相吻合，也得到較好的分類結(jié)果。

在Genbank中未見糙葉五加ITS2和psbA-trnH序列，藤五加和蜀五加psbA-trnH序列的相關(guān)數(shù)據(jù)。

應(yīng)用 ITS2 序列和 psbA-trnH 序列的聚類分析所建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹存在一定差異，在親緣關(guān)系的分析上不夠精準(zhǔn)，還需有較多的數(shù)據(jù)積累才行。

參考文獻(xiàn)

[1] 衛(wèi)平，宋慶生.陜西產(chǎn)四種五加化學(xué)成分的含量測(cè)定[J].西北藥學(xué)雜志，1987，2（3）：13-15.

[2] 簡(jiǎn)毓峰，胡浩斌.短柄五加的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材，2011，34（8）：1302-1306.

[3] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第54卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：86-116.

[4] Flora of China Editorial Committee.Flora of China：V13[M].Beijing：Science Press & St Lious：Missouri Botanical Garden Press，2011：466-472.

[5] 向其柏.五加科植物的新分類群及某些修訂[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1985，9（2）：15-28.

[6] 陳士林，姚輝，韓建萍，等.中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（2）：141-148.

[7] 孫濤，孔德英，滕少娜，等.基于ITS2 條形碼的人參屬物種鑒定研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（19）：5072-5074.

[8] 潘綠昌，李園園，劉紅昌，等.基于ITS2和psbA-trnH序列的忍冬屬5種中藥材DNA條形碼鑒定研究[J/OL].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018-11-15[2020-10-25].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1369.Q.20181115.0924.002.html.

[9] 萬(wàn)如，王亞軍，安巍，等.基于 psbA-trnH 序列條形碼鑒定21 份枸杞屬植物[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：56-59.

[10] 李笑，譚朝陽(yáng)，徐德宏，等.益母草植物DNA條形碼的鑒定研究[J].中國(guó)藥師，2020，23（3）：442-447.

[11] 方潔，呂群丹，陳正道，等.市售覆盆子藥材DNA條形碼鑒定研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2020，37（4）：437-442.

[12] 呂瑞華，馮昭，馬添翼，等.陜西關(guān)中野生商陸資源的ITS2和psbA-trnH 條形碼序列研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（8）：1951-1956.

[13] 鄭夢(mèng)迪，張彥，張寒，等.活血丹及其同屬藥用植物的分子鑒定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（6）：1397-1398.

[14] 李園園，蔡莉，楊繼勇，等.基于ITS2和psbA-trnH序列的金釵石斛DNA條形碼鑒定研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（8）：3516-3524.

[15] 曾旭，李秋實(shí)，王鈐，等.基于 ITS2 條形碼的五加皮基原植物及其易混品的鑒定[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14（2）：15-18.

[16] 陳鏡安，楊璐，李榮釗，等.基于ITS2的竹節(jié)參及其近緣物種和混偽品鑒定評(píng)估[J].中草藥，2018，49（15）：3672-3680.

[17] 劉新星，歐巧明，石有太，等.基于ITS2 序列鑒別道地藥材岷縣當(dāng)歸及其混偽品[J].中草藥，2018，49（20）：4877-4883.

[18] 林鳳越，曹輝，任歡歡，等.基于ITS2序列的人參及同屬易混品西洋參種子的分子鑒定[J].中草藥，2019，50（9）：2188-2193.

[19] 劉金欣，李耿，陳彩霞，等.基于 ITS2 序列的中藥材蒼術(shù)種苗 DNA條形碼鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2018，24（2）：34-38.

[20] 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：494-495.