馬瑞欣

摘 要：通過查閱文獻和實驗，分析總結(jié)色譜-質(zhì)譜分析中內(nèi)標物的要求與作用，內(nèi)標法檢測技術(shù)使用注意事項、優(yōu)勢與不足。

關(guān)鍵詞：內(nèi)標法;同位素內(nèi)標;色譜-質(zhì)譜分析

內(nèi)標法定量是利用待測物濃度和內(nèi)標物濃度的比值與待測物響應值和內(nèi)標物響應值的比值成正比進行定量分析的方法，是經(jīng)典的色譜-質(zhì)譜定量分析方法，廣泛應用于食品安全、醫(yī)學、環(huán)境等領(lǐng)域。

本文將對色譜-質(zhì)譜分析中內(nèi)標物的要求和常用類型、內(nèi)標物的作用、內(nèi)標法使用注意事項、內(nèi)標法的優(yōu)缺點進行分析總結(jié)。

1 內(nèi)標物的要求及其常用類型

內(nèi)標物要求其在樣品中不存在，不與樣品發(fā)生反應，與目標物的物理化學性質(zhì)相似。根據(jù)儀器定性定量原理，色譜分析中要求內(nèi)標物與樣品中的其他組分有良好的分離，質(zhì)譜分析中一般要求與目標物的母離子或子離子的質(zhì)荷比（m/z）不同。有機質(zhì)譜分析中常用2H、13C、15N、18O、34S等穩(wěn)定同位素內(nèi)標[1]，農(nóng)藥、獸藥殘留色譜-質(zhì)譜分析中最為常見的內(nèi)標物是2H和13C同位素內(nèi)標。

2 內(nèi)標物的作用

2.1 監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性

只用于監(jiān)測儀器的穩(wěn)定性時，一般在樣品前處理的最后一步加入等量的內(nèi)標[2-3]，適用于樣品的提取比較充分，基質(zhì)干擾可以忽略的檢測，內(nèi)標法所得校準曲線的線性相關(guān)系數(shù)和定量結(jié)果與外標法相比無顯著差異，內(nèi)標法、外標法定量均可，但是通過每次進樣時內(nèi)標物響應值的變化，能夠?qū)x器的穩(wěn)定性進行判斷，必要時對設備進行維護保養(yǎng)。

2.2 校正基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是質(zhì)譜分析普遍存在的一種現(xiàn)象，分為基質(zhì)抑制效應和基質(zhì)增強效應。內(nèi)標物只用于校正基質(zhì)效應時一般上機分析時在線加入[4]或上機分析前[5]加入。此種情況樣品的提取比較充分，但樣品的基質(zhì)干擾比較大，基質(zhì)標準曲線適用性比較差。由于內(nèi)標價格昂貴，相比于樣品提取前加入同位素內(nèi)標，在線或上機分析時添加適量低濃度的內(nèi)標，可以大大減少內(nèi)標的使用量，節(jié)約檢測成本。同位素內(nèi)標因與目標物具有相同的化學性質(zhì)和相同的保留時間而成為消除基質(zhì)效應首選的內(nèi)標物。

2.3 校正樣品前處理

內(nèi)標物在樣品提取前[6-7]或某個步驟前加入[8-9]，用于校正樣品的前處理損失，同時也可以減小基質(zhì)效應。樣品提取前加入內(nèi)標比在某個步驟前加入能夠獲得更好的回收率[10]。樣品提取前加入內(nèi)標，特別是同位素內(nèi)標，能夠校正前處理過程的損失，降低操作要求，減小基質(zhì)效應，成為獸藥殘留色譜-質(zhì)譜分析中非常經(jīng)典的方法。

3 內(nèi)標法使用注意事項

3.1 內(nèi)標加入量

內(nèi)標法要求內(nèi)標的加入體積要準確并且濃度適當。內(nèi)標加入量是影響檢測結(jié)果的一個比較重要的因素[11-12]，在標準曲線定量時要求標準曲線、樣品中內(nèi)標加入量應保持恒定。內(nèi)標的加入量太低不足以校正儀器波動，對測定結(jié)果影響較大;太高不僅造成浪費，還可能造成污染。當前處理過程涉及到分體積操作且用標準曲線定量時，需注意樣品上機液中內(nèi)標物的理論濃度需與標準系列中內(nèi)標物的濃度相一致，否則可能產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。

3.2 內(nèi)標加入后樣品放置時間

在前處理操作之前加入內(nèi)標用于校正樣品的前處理損失時，應注意保證內(nèi)標物被樣品充分吸附，否則會造成檢測結(jié)果偏低。為證明加入內(nèi)標后樣品放置時間對檢測結(jié)果的影響，設計實驗如下：稱取14個鯉魚空白樣品，每個樣品5.00 g，同時加入孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）外標混合標準溶液，加標量均為4.0 μg·kg-1，混勻，-20 ℃放置4 d后，按照GB/T 19857-2005中鮮活水產(chǎn)品進行實驗。14個樣品分為7組，每組2個平行樣品，加入內(nèi)標混合液的體積完全相同，放置時間分別為5 h、4 h、3 h、2 h、1 h、0.5 h、0 h。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析的實驗結(jié)果見圖1。

實驗結(jié)果證明：孔雀石綠內(nèi)標加入后的放置時間對檢測結(jié)果影響較大，而隱色孔雀石綠則不受放置時間的影響。這可能與內(nèi)標物的性質(zhì)有關(guān)?？兹甘G內(nèi)標物為孔雀石綠-D5苦味酸鹽，隱色孔雀石綠內(nèi)標物為隱色孔雀石綠-D6，隱色孔雀石綠-D6極性較孔雀石綠-D5苦味酸鹽弱，脂溶性強，極易被魚肉吸附，其提取效率與放置時間無關(guān);孔雀石綠-D5苦味酸鹽極性較強，放置時間越短，吸附量越小，提取出來的越多，導致目標物回收率降低。

4 內(nèi)標法的優(yōu)勢與不足

4.1 優(yōu)勢

從定性分析來看，同位素內(nèi)標物峰可以作為目標峰是否發(fā)生漂移的參考依據(jù)，因為同位素內(nèi)標與分析物的物理化學性質(zhì)相近，在色譜-質(zhì)譜分析中常常與目標物有相同的保留時間，可以通過內(nèi)標物的保留時間是否發(fā)生漂移來確定目標物是否發(fā)生漂移。

從定量分析來看，內(nèi)標可以校正目標物在樣品前處理中的損失，降低對儀器穩(wěn)定性和進樣量的嚴格要求，降低質(zhì)譜檢測的基質(zhì)效應，從而得到更好的準確度和精密度。

從實驗操作來看，提取前加入內(nèi)標物的前處理方法對實驗操作的要求比外標法有所降低，對體積的準確性要求沒有外標法嚴格。當目標物有對應的同位素內(nèi)標時，可以直接使用溶劑標準溶液，不必配制基質(zhì)標準溶液，從而可以減少實驗操作，提高檢測效率。

4.2 不足

同位素內(nèi)標物價格較貴，在分析中并不是所有目標物都能找到合適的內(nèi)標物，特別是對于多種物質(zhì)同時檢測時，由于存在極性差異，即使同類物質(zhì)的內(nèi)標同位素也很難抵消基質(zhì)效應，仍需配制基質(zhì)匹配標準溶液來進一步抵消基質(zhì)效應[13-14]。

在定量分析中，我們期望不管在樣品處理和分析過程中有任何變化，分析物和同位素內(nèi)標物的峰面積比為常數(shù)，但實驗中發(fā)現(xiàn)并非如此[15]。實驗中使用同位素內(nèi)標有時不能補償基質(zhì)效應[16]，有時即使有對應的同位素內(nèi)標仍不能獲得滿意的回收率。分析原因可能是同位素內(nèi)標與目標物存在極性上的差異，會導致在樣品提取時二者的提取效率有差異或者是色譜—質(zhì)譜分析中二者到達離子源的時間不同，從而引起基質(zhì)效應不同。

內(nèi)標法做為水產(chǎn)品藥物殘留色譜—質(zhì)譜分析的常用方法，樣品的個體差異需引起重視。有時同種水產(chǎn)品同批次進行檢測，不同個體之間回收率會存在較大差異。分析原因可能是不同的個體對于待測物和其對應內(nèi)標的回收率造成的影響不同所致。

5 結(jié)論

內(nèi)標法作為一種定量分析方法，雖然存在不足，但在色譜—質(zhì)譜分析中，同位素內(nèi)標法仍不失為一種降低基質(zhì)效應，提高準確定性定量分析的重要方法。

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（收稿日期：2021-07-01）