龍麗坤，趙 寧，夏 蔚，李蔥蔥，董立明，閆 偉，李飛武

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，長春 130033）

0 引言

生物技術(shù)為全球農(nóng)業(yè)科技注入強大的動力。轉(zhuǎn)基因玉米是全球獲得商業(yè)化批準最多的轉(zhuǎn)基因作物。根據(jù)ISAAA(International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications)最新統(tǒng)計顯示，2018年全球已批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因作物31種，包括的517種轉(zhuǎn)化體中237種為轉(zhuǎn)基因玉米[1]?？瓜x、耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米品種選育是中國轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椫攸c研發(fā)領(lǐng)域之一。自2008年重大科技專項啟動以來，中國轉(zhuǎn)基因作物自主研發(fā)能力顯著提升，大量轉(zhuǎn)基因玉米新品系陸續(xù)進入環(huán)境安全評價階段。CM8101轉(zhuǎn)基因玉米是中國農(nóng)科院自主研發(fā)，通過外源導入Cry1Ab-Ma和bar基因，具有優(yōu)良的抗蟲性和除草劑耐受性，是國內(nèi)具有推廣應用前景的轉(zhuǎn)基因玉米新品系之一。對新品系CM8101轉(zhuǎn)基因玉米建立準確可靠的檢測方法，不僅是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然要求，也是中國轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的技術(shù)支撐[2]。

目前，轉(zhuǎn)基因作物檢測主要基于核酸和蛋白質(zhì)開展鑒定和分析[3]?；诤怂岬霓D(zhuǎn)基因檢測技術(shù)除傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)之外，等溫擴增技術(shù)(LAMP)[4]、基因芯片技術(shù)(Gene chip)[5]、數(shù)字PCR技術(shù)(Digital PCR)[6-7]和生物傳感器(Biosensor)[8]等新型檢測技術(shù)也不斷研發(fā)和應用，但這些新技術(shù)也存在問題和不足，如設(shè)備專業(yè)性強，技術(shù)要求高、易污染等?；诤怂岬腜CR定性檢測方法具有成本低、靈敏度高、特異性強、操作相對簡單等特點，成為國家標準、行業(yè)標準等推薦的主要轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)，并被廣泛應用于研發(fā)單位和檢測機構(gòu)。CM8101作為新的轉(zhuǎn)基因玉米品系，其特異性定性PCR檢測方法尚未建立。本研究以抗蟲、耐除草劑玉米CM8101轉(zhuǎn)化體3’端插入位點的特異性序列為依據(jù)，建立轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，并對該方法的特異性、靈敏度、重復性進行測試，旨在為對該轉(zhuǎn)化體的安全評價、行政監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 轉(zhuǎn)基因玉米CM8101、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩譠58均為玉米純合體，由中國農(nóng)科院提供。

特異性測試樣品中其他轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因油菜等樣品為粉末標準品，均由本實驗室收集保存，涉及的各類作物轉(zhuǎn)化體見表1。多種轉(zhuǎn)化體按質(zhì)量分數(shù)混合，分別制成混合樣品，每個轉(zhuǎn)化體含量為1%，以同種非轉(zhuǎn)基因作物粉末為填充物。

表1 特異性測試包含的轉(zhuǎn)基因作物

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。Premix Ex Taq(Perfect Real Time)、DL2000分子量Marker購于大連寶生物工程有限公司。引物由上海生工生物公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 臺式冷凍離心機（美國eppendorf）、ND8000紫外分光光度計(Thermo scientific)、C1000型梯度PCR儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 將所有樣品粉末，按照植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化）操作說明書提取樣品基因組DNA，ND8000紫外分光光度計測定DNA質(zhì)量和濃度，用1×TE緩沖液將純化的DNA溶液稀釋至12.5 mg/L。

1.2.2 引物序列 CM8101玉米特異性擴增引物：8101-F7：5’-GGAAGCATAAAGTGTAAAGCC-3’；8101-R7：5’-CATTTCTTGGTCAAAACCTCAC-3’。擴增產(chǎn)物大小為242 bp。

內(nèi)標準基因采用zSSIIb基因，參考農(nóng)業(yè)部1861號公告-3-2012《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測玉米內(nèi)標準基因定性PCR方法》，引物序列為：zSSIIb-1F：5’-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3’；zSSIIb-2R：5’-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3’。擴增產(chǎn)物大小為151 bp。

引物由上海生工有限公司合成，用1×TE緩沖液稀釋至10 μmol/L的工作液。

1.2.3 PCR反應 PCR反應體系：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs混合溶液2 μL、10 μmol/L上下游引物各 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O補齊至25 μL。

PCR擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72℃ 7 min；10℃。PCR擴增結(jié)束后，10 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化體特異性引物設(shè)計

根據(jù)CM8101玉米5’端和3’端邊界序列信息（發(fā)明專利CN 109536490 A），采用引物設(shè)計軟件Premier 5.0，設(shè)計轉(zhuǎn)化體特異性引物7對，引物序列、位置及擴增產(chǎn)物大小等信息見表2。通過對低濃度DNA樣品的測試，根據(jù)引物擴增條帶清晰度、非特異性擴增以及引物二聚體多少等，選擇表現(xiàn)相對優(yōu)異的3’端引物序列8101-F7/8101-R7作為方法候選引物進行后續(xù)方法參數(shù)的測定。3’端邊界序列及引物8101-F7/R7位置見圖1。

表2 CM8101玉米特異性定性PCR檢測引物信息

圖1 CM8101玉米的3’端邊界序列及引物位置

2.2 特異性檢測

將CM8101制成質(zhì)量分數(shù)1%的粉末，陰性對照為非轉(zhuǎn)基因玉米粉末，其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣品、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣品、轉(zhuǎn)基因棉花油菜混合樣品、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣品，作為特異性測試樣品（見表1），提取樣品DNA，按照常規(guī)PCR普通擴增體系進行內(nèi)參基因zSSIIb和CM8101特異性片段的PCR擴增，測試本方法特異性。

內(nèi)源zSSIIb基因擴增，作為DNA樣品質(zhì)量和純度的質(zhì)控，經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，僅在陰性玉米、CM8101玉米和其他轉(zhuǎn)基因玉米出現(xiàn)玉米內(nèi)源基因擴增條帶(151 bp)，表明測試樣品適用于特異性檢測。

圖2 特異性測試樣品內(nèi)標準基因zSSIIb擴增結(jié)果

CM8101特異性片段擴增電泳圖譜見圖3所示，僅在CM8101玉米樣品中擴增出與預期大小一致的特異性PCR產(chǎn)物(242 bp)，其他轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因油菜、轉(zhuǎn)基因棉花樣品中未得到任何擴增。因此，特異性檢測結(jié)果表明，本方法具有嚴格特異性。

圖3 特異性測試樣品CM8101特異性片段擴增結(jié)果

2.3 靈敏度測試

將CM8101玉米基因組DNA與其非轉(zhuǎn)基因玉米對照樣品DNA按不同質(zhì)量比混合，制成DNA質(zhì)量分數(shù)分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的CM8101玉米樣品，進行方法靈敏度測試。每個擴增體系模板用量均為50 ng玉米基因組DNA，內(nèi)參基因zSSIIb的擴增用于判定作為DNA樣品提取質(zhì)量如圖4所示。特異性片段靈敏度測試結(jié)果如圖5所示，PCR檢測反應體系中加入50 ng玉米基因組DNA模板時，在電泳圖譜上顯示，1%～0.05%的特異性片段均有預期片段擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序證實，該片段為預期的特異性序列。

圖4 靈敏度測試樣品內(nèi)標準基因zSSIIb擴增結(jié)果

圖5 靈敏度測試樣品CM8101特異性片段擴增結(jié)果

2.4 檢出限測定

為確定本方法檢出限，借鑒中國已發(fā)布實施的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCR檢測方法標準的技術(shù)要求，使用CM8101玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米對照樣品基因組DNA混合配制60份CM8101玉米DNA含量為0.1%的樣品，進行PCR擴增。

結(jié)果如圖6所示，60份試樣均穩(wěn)定擴增出預期大小一致的PCR產(chǎn)物，表明在PCR檢測反應體系中加入50 ng DNA模板時，本方法的檢出限可達到0.1%。單拷貝玉米基因組雙鏈DNA的平均質(zhì)量約為2.5 pg，由于本研究中使用CM8101玉米為純合體，因此，本檢測方法的檢出限約20拷貝。因此，本方法適用于對抗蟲耐除草劑玉米CM8101品系的高靈敏檢測。

圖6 CM8101玉米檢測方法檢出限測定

2.5 穩(wěn)健性測試

為了測試本特異性PCR方法對CM8101檢測的穩(wěn)健性，針對PCR檢測方法的反應體系和反應程序，以1%的CM8101為模板，選擇退火溫度和引物濃度梯度2個關(guān)鍵參數(shù)進行正交試驗。退火溫度設(shè)置分別為52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃，引物濃度梯度為0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L，共測試24個退火溫度/濃度梯度組合。結(jié)果見圖7，圖中可見，不同的引物濃度和退火溫度處理中本方法均表現(xiàn)出良好的擴增特異性，不同退火溫度表現(xiàn)出較為一致的擴增效率，特異性擴增條帶清晰、無非特異擴增、引物二聚體較少，因此本方法可以穩(wěn)定地檢出CM8101特異性片段，再現(xiàn)性良好。

圖7 CM8101玉米特異性PCR法退火溫度的穩(wěn)定性測試

綜合考慮玉米內(nèi)標準基因zSSIIb的定性PCR檢測方法的反應體系和反應程序，結(jié)合本研究結(jié)果，反應體系中的引物終濃度建議采用0.2 μmol/L，反應程序中的退火溫度設(shè)定為58℃。

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因新品種研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化推進，作物安全評價和監(jiān)管面臨更多挑戰(zhàn)，迫切需要不斷開發(fā)更精準、快速、高通量檢測方法提供技術(shù)支撐[9-10]。PCR技術(shù)是應用最廣泛的轉(zhuǎn)基因檢測方法，以PCR為主要技術(shù)手段的轉(zhuǎn)基因檢測分為4類，即轉(zhuǎn)化元件篩選檢測[11]、靶標基因檢測[12-14]、構(gòu)建載體特異性檢測[15]和轉(zhuǎn)化體特異性檢測[16]。Datukishvili等[17]建立了CaMV35S、Nos、EPSPS和Cry1Ab4個轉(zhuǎn)基因參數(shù)的多重PCR檢測體系，檢測限可以達到0.1%的RRS大豆和MON810玉米。應用數(shù)字PCR技術(shù)Fu等[18-20]，建立了無需預處理的定性篩選檢測方法，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因作物的快速篩選。但研究表明，此類方法對多種轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體難以達到一致的檢測限。對新研發(fā)的轉(zhuǎn)基因作物，仍需驗證其適用性。

轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米CM8101是由中國農(nóng)科院研發(fā)的轉(zhuǎn)Cry1Ab-Ma基因和bar基因抗蟲耐除草劑玉米新品系，經(jīng)多年多點鑒定表明，該品系對玉米螟、棉鈴蟲、粘蟲等鱗翅目害蟲具有良好的抗蟲性、同時兼具草銨膦除草劑耐受性，在中國具有重要產(chǎn)業(yè)化應用前景，因此，對CM8101轉(zhuǎn)基因玉米建立一種穩(wěn)定可靠的特異性檢測方法是安全評價和監(jiān)管的必要支撐。

轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測方法靶標主要是外源插入序列與靶標物質(zhì)基因組連接區(qū)域的DNA序列，這種方法具有高度的專一性，是轉(zhuǎn)化體特異性檢測的最廣泛應用的檢測方法，已成為國際上轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)和安全評價中的基本技術(shù)要求[21]。目前，大多數(shù)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物品系均已建立定性PCR檢測體系，應用于轉(zhuǎn)基因品系特異性鑒定和分析。Jae-HwanKim等應用多重PCR技術(shù)建立了16種轉(zhuǎn)基因玉米五重PCR鑒定方法[22]。利用Realtime PCR技術(shù)各國學者陸續(xù)建立了轉(zhuǎn)基因玉米BVLA430101、98140等轉(zhuǎn)化體特異性定性定量檢測方法[23-24]，這些新方法檢測特異性強，檢測限達到0.1%～0.25%。但這些方法普遍存在技術(shù)要求較高、需要標準物質(zhì)等問題。本研究建立的CM8101凝膠檢測的定性PCR檢測方法，設(shè)備普及率高，成本低，技術(shù)適用范圍廣。本方法檢測靈敏度達到0.1%，檢測限為20 copies，與各類新方法達到相同的分辨力水平。因此易于在中國眾多研發(fā)單位和檢測機構(gòu)推廣應用[25]。

本研究以轉(zhuǎn)基因玉米CM8101 3’端插入位點特異性序列為依據(jù)，通過篩選檢測引物、優(yōu)化反應體系、反應程序等技術(shù)參數(shù)測試，建立了CM8101的轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法，達到了與現(xiàn)行有效的其他同類轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測方法標準相同的技術(shù)指標，同時本方法考慮到與其他相關(guān)國家標準的兼容性，確保在實際工作中能夠?qū)⒈痉椒ㄅc其他標準高效配合使用。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)基因玉米CM8101的3’端特異序列，應用普通PCR技術(shù)，本研究建立了CM8101定性鑒定方法。結(jié)果表明：本方法能夠精準檢測出CM8101玉米樣品，具有良好的品系特異性，方法檢測靈敏度可達0.1%。本方法各項技術(shù)指標能夠滿足《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》轉(zhuǎn)基因作物安全監(jiān)管的技術(shù)要求，可為轉(zhuǎn)基因玉米CM8101的鑒定提供有效的技術(shù)手段。