顧 凡，晏 恒，趙存朝，2，劉俐彤，陶 亮，2 ，田 洋，2，3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室，云南 昆明 650201）

百香果（Passiflora edulisSims）是西番蓮科西番蓮屬的草質(zhì)藤本植物，又稱為雞蛋果、西番蓮、巴西果、情人果等[1]，在我國廣泛種植于云南、廣西、海南等地。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，百香果中含有大量生物活性成分，如黃酮類、生物堿類[2]等，具有抗炎[3]、抗氧化[4]、降糖[5]、抗焦慮[6]和抗衰老[7]等功效。百香果汁顏色為金黃色，香味濃郁，含有17種氨基酸、維生素、微量元素等160多種有益成分[8-12]。國內(nèi)對百香果果酒研究較多，有直接發(fā)酵釀造的百香果果酒[13-15]，有百香果和其他果蔬復配釀造的果酒[16-19]，有百香果和辣木提取物[20-21]、蕎麥[22]、靈芝[23]釀造的果酒，但通過百香果和葡萄混釀的果酒鮮有報道。

葡萄為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，富含蛋白質(zhì)、糖、有機酸、維生素及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，成熟后的葡萄糖酸比平均在40左右，具有高糖低酸的特性[24]，特別適合加工果酒，葡萄酒工藝成熟具有極高的生物價值，深受國內(nèi)外的喜愛和熟知，是熱銷的產(chǎn)品。

百香果果汁含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，且清香味濃郁，但酸度較高，影響了百香果酒的開發(fā)。將葡萄加以混釀，中和口感，緩解百香果汁的酸味，使營養(yǎng)物質(zhì)得到充分利用，解決了人為添加甜味劑造成的感官品質(zhì)下降，同時形成了獨特的果香味葡萄酒。百香果作為云南省部分地區(qū)的重點扶貧項目，產(chǎn)量、產(chǎn)值逐年擴大，開發(fā)葡萄百香果酒產(chǎn)品對拉動云南省經(jīng)濟增長、提高百香果利用價值、減少鮮果積壓浪費具有重要意義。本研究立足云南葡萄和百香果的產(chǎn)量、質(zhì)量優(yōu)勢，通過復合菌種發(fā)酵，開發(fā)出一款具有葡萄、百香果果味、酸甜適中、口感清爽的風味果酒，為生產(chǎn)高品質(zhì)的果酒提供一定的理論基礎(chǔ)，同時對云南水果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有一定的推動作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果、葡萄：市售；混合菌種（葡萄酒活性干酵母∶耐高溫活性干酵母=1∶1）：安琪酵母有限責任公司；纖維素酶（50 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）：湖南新鴻鷹生物工程有限公司；碳酸鈣（食品級）：河南萬邦實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

WZB數(shù)顯折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；PHS-3CW數(shù)顯pH計：杭州德為儀器有限公司；M277465酒精測量儀：河北青縣儀器有限公司；SC-60分光光度計：廣東冰天制冷設備有限公司；HH-2恒溫水浴鍋：常州億通分析儀器有限公司；HPX-9272ME恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；WT20002電子天平：杭州萬特衡器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄百香果酒發(fā)酵工藝流程及操作要點

原料處理：將成熟百香果和葡萄清洗，葡萄榨汁100目紗布過濾，百香果去皮取果肉與水按質(zhì)量比1∶1混合打漿。

酶解：添加0.1%的果膠酶和纖維素酶，45 ℃酶解2 h。

過濾：100目紗布過濾后與葡萄汁混合均勻。

加料：添加蔗糖調(diào)整混合汁初始糖度，碳酸鈣調(diào)節(jié)適合酵母發(fā)酵的酸度，pH值至3.5左右為宜。

殺菌：調(diào)整混合汁基質(zhì)中SO2含量至50 mg/kg。

活化酵母：混合菌種于10倍溫水中，35 ℃水浴鍋活化0.5 h后添加0.4%至果汁混合液中。

發(fā)酵：在一定溫度條件下的恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵一定時間。

離心、陳釀：發(fā)酵后的果酒4 000 r/min離心15 min，在15 ℃條件下陳釀10 d。

1.3.2 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化

通過單因素試驗研究果汁比例（葡萄汁與百香果汁體積比）（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、初始糖度（21°Bx、22°Bx、23°Bx、24°Bx、25°Bx）、發(fā)酵溫度（21 ℃、22 ℃、23 ℃、24 ℃、25 ℃）、發(fā)酵時間（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）對葡萄百香果酒感官評分和酒精度的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗對葡萄百香果酒工藝進行優(yōu)化，確定最佳工藝及配方。二次通用旋轉(zhuǎn)組合分析因素和水平見表1。

表1 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗的因素與水平Table1 Factors and levels of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization

1.3.3 測定方法

葡萄百香果酒感官評定：邀請10名專業(yè)人士從外觀、滋味、香氣、典型性四個方面參照GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求，建立百香果葡萄復合果酒感官評分標準，滿分100分，感官評分標準見表2。

表2 葡萄百香果酒感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards of grape-passion fruit wine

酒精度：按照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》方法測定；總酸：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；糖度：手持糖度儀測定；總糖含量：按照二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）測定；pH值：使用pH計測定；細菌菌落數(shù)：按照平板計數(shù)法測定；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》中MPN計數(shù)法執(zhí)行；沙門氏菌：按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》方法測定；金黃色葡萄球菌：按照GB 4789.10—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》方法測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2.16對試驗驗數(shù)據(jù)進行整理，Origin 8.5繪圖，SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標準差”表示，DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行二次通用旋轉(zhuǎn)設計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 果汁配比對葡萄百香果酒酒精度和感官評分的影響

由圖1可知，隨著百香果汁比例的增加，葡萄百香果酒的感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在葡萄汁∶百香果汁配比為1∶3（V/V）達到最高，感官評分為（92.6±1.6）分。此時，產(chǎn)品百香果味濃郁、葡萄的后甘味純正，感官品質(zhì)最佳，隨著百香果汁添加比例的增加，百香果的味道掩蓋了葡萄風味，果酒偏酸，后味寡淡。不同果汁配比條件下，酒精度呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，且后期趨于平穩(wěn)，可能是因為加入百香果汁中含有氨基酸、維生素、微量元素給酵母增加了營養(yǎng)物質(zhì)，從而導致酒精度升高。綜合比較分析最終選擇葡萄汁與百香果汁配比為1∶3（V/V）。

圖1 果汁配比對葡萄百香果酒的酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of juice ratio on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.2 不同初始糖度對葡萄百香果酒酒精度及感官評分的影響

由圖2可知，隨著初始糖度的升高，葡萄百香果酒的感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在初始糖度為23°Bx時，葡萄百香果酒感官評分最高為91分。隨著初始糖度的繼續(xù)升高，感官評分降低，這是由于初始糖度的升高，導致發(fā)酵體系的滲透壓增加，一定程度抑制了酵母發(fā)酵能力，造成其發(fā)酵變慢，產(chǎn)品甜度過高，果酒口味寡淡，這與曹麗娟等[25]的研究結(jié)果一致。葡萄百香果酒酒精度隨初始糖度的升高的變化趨勢與感官評分類似，初始糖度為24°Bx時，酒精度最高為12.5%vol，初始糖度為23°Bx時，酒精度為12.3%vol，與初始糖度為24°Bx時相差不大。因此綜合考慮感官評分和酒精度，確定最佳的初始糖度為23°Bx。

圖2 不同初始糖度對葡萄百香果酒的酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of different initial sugar contents on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對葡萄百香果酒酒精度及感官評分的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，葡萄百香果酒感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，發(fā)酵溫度23 ℃時感官評分達到最高為（93.2±1.4）分，此溫度條件下葡萄百香果酒符合果酒標準，口感柔順，具備獨特的果酒風味。酒精度隨發(fā)酵溫度變化，也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在發(fā)酵溫度24 ℃時，酒精度達最高為12.3%vol，可能是由于隨著溫度的升高達到酵母的最適發(fā)酵溫度，乙醇產(chǎn)量增加。趨勢下降可能是由于溫度繼續(xù)升高，酵母生長旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)用于自身生長分化，乙醇產(chǎn)量減少[26]。所以綜合考慮感官評分和酒精度，最終選擇發(fā)酵溫度為23 ℃。

圖3 不同發(fā)酵溫度對葡萄百香果酒的酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of different fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.1.4 不同發(fā)酵時間對葡萄百香果酒酒精度及感官評分的影響

由圖4可知，感官評分隨發(fā)酵時間的延長，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，第7天時達到最高為（89.4±1.5）分，上升趨勢是由于酵母菌逐漸發(fā)酵達到最適時間，形成最佳的果酒風味，下降趨勢可能是由于發(fā)酵時間過長代謝產(chǎn)物CO2增多，溶于果酒導致偏酸，感官評分下降，這與王登宇等[27]研究結(jié)果一致。酒精度隨時間的延長，呈現(xiàn)出先上升后基本不變的趨勢，第7天酒精度為12.3%vol，上升趨勢可能由于酵母菌繁殖旺盛，發(fā)酵速率較快，酒精度不斷增加。穩(wěn)定趨勢可能是由于發(fā)酵時間長，酵母菌生長達到穩(wěn)定期，產(chǎn)酒能力達到最大值，酒精度不再增加，與菌種先增長后趨于穩(wěn)定的生長曲線的趨勢相呼應[28]，這與程宏楨等[26]的研究結(jié)果類似。所以綜合果酒的感官評分和酒精度，選擇發(fā)酵時間為7 d。

圖4 不同發(fā)酵時間對葡萄百香果酒的酒精度和感官評分的影響Fig.4 Effect of different fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of grape-passion fruit wine

2.2 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗

2.2.1 二次通用旋轉(zhuǎn)回歸組合試驗

通過DPS7.05軟件對表3試驗結(jié)果進行分析，并得到以感官評分為目標的二次回歸模型方程：

表3 葡萄百香果酒釀造工藝優(yōu)化二次通用旋轉(zhuǎn)試驗結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of second universal rotating combination experiments for grape-passion fruit wine brewing process optimization

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗

由表4可知，F(xiàn)1=2.088 96＜F0.05（5，5）=5.05，失擬項差異不顯著，未知因素對試驗結(jié)果影響較小。對回歸模型進行擬合檢驗F2=7.724 72＞F0.05（9，10）=3.13，達到極顯著水平，說明方程與實際情況擬合良好，預測值跟實際值吻合相當好，能反映感官評分與果汁比例、發(fā)酵溫度、初始糖度的關(guān)系。對回歸系數(shù)顯著性檢驗表明，一次項X2，交互項X1X2、X1X3、X2X3均未達到顯著水平，但二次項系數(shù)具有相關(guān)性，因此在這些微弱的交互項原則上不能刪除。在a=0.10顯著水平剔除不顯著項簡化后的回歸方程：

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗結(jié)果方差分析Table4 Analysis of variance of second universal rotating combination experiment results

通過二次通用旋轉(zhuǎn)組合試驗建立的回歸方程的偏回歸系數(shù)的絕對值大小可以判斷出各個因素對感官評分的影響大小順序：初始糖度（X3）＞果汁比例（X1）＞發(fā)酵溫度（X2），且均為正效應。

2.3 驗證試驗

以零水平的平均值84.25為臨界值，獲得大于臨界值的28個方案，各變量取值的頻率分布見表5。

由表5可以看出，在95%的置信區(qū)間感官評分大于84.25的優(yōu)化方案為：果汁比例1∶3.543～1∶4.109、發(fā)酵溫度22.703～23.297 ℃、初始糖度23.646～24.149°Bx。為了滿足實際化工業(yè)生產(chǎn)可將優(yōu)化方案設為果汁比例1∶4（V/V）、發(fā)酵溫度23 ℃、初始糖度24°Bx。對于此方案驗證得到感官評分為84.35分，酒精度為12.3%vol，與優(yōu)化方案的理論值接近，進一步證實了方案的可靠性。

表5 各變量取值的頻率分布Table5 Frequency distribution of values of each variable

2.4 產(chǎn)品質(zhì)量

對最佳發(fā)酵工藝條件下的葡萄百香果酒進行衛(wèi)生指標檢測和感官評價，成品葡萄百香果酒具有濃郁百香果味及色澤金黃、透明澄清，富有光澤，無雜質(zhì)酸甜適中、口感清爽。糖含量（3.08±0.38）g/L，總酸含量為（6.65±0.29）g/L，菌落總數(shù)≤30 CFU/mL，大腸菌群≤3 MPN/mL，致病菌未檢出等衛(wèi)生指標符合標準要求，即開發(fā)的葡萄百香果酒的符合產(chǎn)品要求、品質(zhì)較佳。

3 結(jié)論

本試驗對葡萄百香果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，葡萄百香果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為酵母添加量（葡萄酒活性干酵母∶耐高溫活性干酵母=1∶1）為0.4%、葡萄汁∶百香果汁1∶4（V/V），初始糖度24°Bx、發(fā)酵溫度23 ℃、發(fā)酵時間7 d，在此條件下，得到的葡萄百香果酒果味濃郁、色澤金黃、酸甜適中、口感清爽，感官評分為84.35分，其酒精度為（12.3±1.3）%vol，糖含量（3.08±0.38）g/L，總酸含量為（6.65±0.29）g/L，符合國家標準要求，是一款品質(zhì)較佳的風味果酒。